qPCR实验操作流程--精选文档
6页1、Q-PCR实验流程一、 实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、 总RNA抽提1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,吹打混匀,并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2) 加入200l氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与
2、第一步的顺序一致)3) 4下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)4) 沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5) 4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀),去上清;6) 用75乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。7) 视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组 使用RNase-free的DNase (Promega),按以下体系配置反应液,37消化30min,65灭活10min。RNA DNase 10 x buffer H2O(RNase free) RNasin
3、 30201039.50.5lllll总体积100l 然后按以下步骤操作: 1) 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。2) 加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。3) 加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20静置15min;4) 4下,14,000g离心15min,收集RNA沉淀,去上清;5) 用75乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6) 加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1) 纯度检测:取1l RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。2) 总RNA完整性检测:取RNA样品1l,1琼脂糖凝胶电泳80V20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA:1) 在RNase
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