酶的发酵生产

1、酶工程第一章 绪论第二章 酶的发酵生产 第三章 酶的分离纯化第四章 酶分子修饰第五章 酶与细胞固定化第六章 酶反应动力学第七章 酶的应用第一章 绪 论第一节 酶的概述第二节酶工程概述第三节酶的生产方法第四节酶的应用前景第一节 酶 的 概 述一.酶（enzyme）的概念二. 酶的研究历史三. 酶的分类与命名四. 酶的活力测定一.酶（enzyme）的概念1酶是催化剂（catalyst） 所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。酶在化学反应中就是充当这样的角色。2酶是一种特殊的催化剂3酶是生物催化剂酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。其具有催化的高效性、高度专 一性及化学本质是蛋白质的特点。（1）酶具有催化的高效性酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH）,极大地提高反应速度，与非酶催化剂相 比，酶的催化效率可高出 1071012倍。如： 2H2O22H2O + O2该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：5.6 X 10-4mol/mol Fe+-S6 0X 10-1mol

2、/mol 血红素S、3.5 X 106mol/mol过氧化氢酶S(2)酶具有催化的高度专一性(specificity)酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应 的特性。酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性： 酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。淀粉酶、蛋白 水解酶也具有这种专一性。c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。如：延胡索酸(反丁烯二酸)酶只专一催化于L-苹果酸和反丁烯二酸，兼具立体异构与顺 反异构专一性。(3) 酶的化学本质是蛋白质 酶的化学本质是蛋白质，主要从以下几个方面来认识：a. 酶的化学本质是蛋白质的依据b. 结合有辅助因子的酶中，蛋白质是其高效和高度专一催化特性的主导因素c. RNA性质的生物催化剂的发现，并未否定“酶的化学本质是蛋白质”的结论i. 酶

3、与蛋白质一样是高分子胶体物质，且为两性电解质。ii导致蛋白质变性的因素，如酸、碱、热、紫外线以及其他蛋白变性剂，也能使酶失活 逍.酶也能被蛋白水解酶水解而失去活性。iv对高纯化的酶进行组成分析，表明其或者是单纯蛋白，或者是蛋白质与其他小分子物质构 成的络合物(即结合蛋白)。v根据核酸酶(RNase)的一级结构，人们已经从氨基酸开始，人工合成了具有催化活性的 蛋白质产物。i 辅助因子： 通常是小分子物质，与酶结合在一起，共同完成酶的催化过程。包括辅酶和活化剂两种 类型。i 辅酶与活化剂的区别： 逍 辅酶也具催化力，但其催化效率和专一性都较酶差。如：血红素是过氧化氢酶的辅酶，但其催化效率是过氧化氢酶的百万分之一；磷酸吡哆醛是转氨酶的辅酶，但其可以催化L-谷氨酸的转氨基、脱羧以及异构为D-谷 氨酸等多种反应。综上，在酶的化学组成中，虽然有除蛋白质以外的其他成分，但是，蛋白质仍然是酶高 效和高度专一催化特性的主导因素。iRNA性质的生物催化剂的发现：70 年代末80 年代初期，由于某些发现，使“蛋白质是酶的化学本质”的观念受到强有力 的冲击。此后，又有许多类似的报道。所有的事实都说明：某些RN

4、A的确具有催化活性。为了和蛋白质性质的生物催化剂酶（enzyme）相区别，Cech等将他们发现的RNA性质的生物催化剂称为 ribozyme。其中几个典型的事例如下：ii Ribozyme发现的生物学意义：Ribozyme 的发现是现代生物学中的一个重大突破，其意义主要表现在以下几点： 它表明 RNA 除了作为遗传信息的载体外，还可能有其他的生物学功能。 它表明除了蛋白质性质的生物催化剂酶以外，还可能存在其他类型的生物催化剂。 为分子生物学研究，尤其是 RNA 研究提供了一种新的工具，新的思路。 为探索生命起源提供了一种新的、重要的信息。逍 Ribozyme的发现并未否定“酶的化学本质是蛋白质” 目前已知的酶，基本上都是蛋白质性质的，或是以蛋白质为主导核心成分。酶是蛋白质性质的生物催化剂，并不排斥还存在其他类型的生物催化剂。Enzyme 和 Ribozyme 是两个并列的概念。（1）所有的酶都是生物体产生的，几乎所有的生物体都能合成酶。（ 2）酶和生命活动密切相关，主要表现在a. 酶参与了体内所有的生命活动和生命过程b. 酶组成分布是生物进化与组织功能分化基础c. 酶在多种水平上可调节

5、以适应生命活动的需要。综上，对于酶，可以有如下概念 酶是一种由生物体产生的，具有高效和高度专一催化活性的，与生命活动密切相关的蛋 白质性质的生物催化剂。二. 酶的研究历史1. 我国古代劳动人民积累了丰富的酶学经验，为后来酶的研究做出了贡献2. 近代酶研究的历史概况3. 现代酶学研究发展的方向真正系统的对酶的认识和研究应从十九世纪开始，其中许多重要的事件标志着酶研究的进程。（1）1833年Payen和Persoz从麦芽抽提物中，用酒精沉淀得到了一种热不稳定的活性物质， 他可促使淀粉水解为可溶性的糖。他们将这种物质称为淀粉酶（diastase）。（2）19 世纪中叶，巴斯德等对酵母的酒精发酵进行研究，指出酵母中存在一种能使葡萄糖转 变为酒精的物质。（3）1878 年库尼首次提出酶的概念，将这种在酵母中使葡萄糖转变为酒精的物质称为酶 （enzyme）。Enzyme这个字来自希腊文，意为“in yeast”（在酵母中）。（ 4） 1896 年，巴克纳兄弟发现酵母无细胞抽提液，也能将葡萄糖转变为酒精。表明酶不仅胞 内也可在胞外起催化作用。由此，酶的研究开始在化学研究已建立的基础上进行。（5）18

6、94 年, Emil Fischer通过对糖代谢中一些酶的研究，发现了酶作用的专一性。提出了“锁 钥学说”，来解释这种专一性。（ 6） 1913 年 Michaelis 和 Menten 提出了中间产物学说，推导出了米氏方程。（7）1926 年, Sumner获得了第一个结晶的酶，即脲酶，并证明他具有蛋白质性质，提出了酶 的化学本质是蛋白质的观点。（8）1960年测出了核糖核酸酶的氨基酸顺序；1965年用x-射线技术推测了溶菌酶的三维结构， 同时提出了酶作用机制的许多理论。（9）1958年Koshland提出了诱导契合理论，解释酶的催化机制和专一性；1961年Monod及 其同事提出了变构酶模型。（10）1969年首次Gutte和Merrifield由氨基酸单体化学合成具有活性的牛胰核糖核酸酶。（11）1982年，Cech等发现了具有催化作用的RNA（Ribozyme）。（12）1986 年， Pollack 等用预先设计好的某酶过渡态类似物为半抗原，免疫动物以后，制得 可与该抗原相结合的抗体，该抗体具有催化活性，称为抗体酶（Abzyme）。抗体酶的出现，为 酶结构与功能研究以及酶的应

7、用等方面都开辟了一个全新的领域。（1）夏禹时代（距今约四千多年），我国古代劳动人民已能酿酒。酒即是酵母发酵的产物，是细胞内酶作用的结果。我国古代所言的酒母和曲，就含有大量的酵母和丰富的酶。（2）约三千多年前，我国劳动人民就已能制饴糖（麦芽糖），这就是利用麦曲含有的淀粉酶将 淀粉降解为麦芽糖。（3）约公元十世纪，我国劳动人民已能用豆类制酱，豆酱主要是利用霉菌蛋白酶将豆类蛋白 质水解所得的食品。将其压榨以后，可得酱油。现代酶学研究主要沿着两个方向发展（1）酶的分子生物学方向：其主要任务是要从分子水平上更深入揭示酶结构与功能的关系； 酶催化机制和调节机制；酶与生命活动的关系等理论问题，进一步设计酶、改造酶、在基因水 平上进行酶的调节控制。（2）酶工程方向：其主要任务是研究如何经济有效地进行酶的生产、制备、应用，将基因工 程、以及分子生物学的最新研究成果用于酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器等。三. 酶 的 分 类 与 命 名1酶的分类 酶的种类很多，目前发现的酶约有3700多种，为了更好地研究酶、应用酶，国际酶学委 员会推荐了酶的分类系统，该系统根据酶的催化作用类型，将已知酶为六大类

8、：(1) 氧化还原酶类(Oxidoreductases)(2) 转移酶类(Transferases)3) 水解酶类( Hydrolases)4) 解合酶类( Lyases)5) 异构酶类( Isomerases)6) 合成酶类( Ligases 或 Synthetases)例2催化D-已糖磷酸化为D-已糖-6磷酸反应的酶 习惯命名：已糖激酶（hexokinase） 系统命名：ATP： D-已糖6-磷酸转移酶（ ATP： D-hexose 6-phosphotransferase）3酶的标码 为了更简便清楚地识别每一种酶，国际酶学委员会对每一个酶都用4个数字进行编码， 称为酶的标码。如：醇脱氢酶，标码为 EC 1.1.1.1 已糖激酶，标码是 EC 2.7.1.1其中EC代表酶委员会系统（Enzyme Commission），前三个数字分别表示酶所属的大 类、亚类 、亚亚类，根据这三个数字，可以判断出酶的催化类型和性质。第四个数字表示该 酶在亚亚类中占有的位置，有了这四个数字，就可确定具体的酶。四. 酶的活力测定1酶活力的含义酶活力是指在一定条件下，酶所催化的化学反应进行的速度。反应速度

9、越大，意味着酶活力越高。2酶的活力测定3酶的活力单位4固定化酶的活力测定2酶的活力测定 测定酶活力，就是测定酶所反应的速度，并且是初速度。(1)酶反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的增加量。V =ds/dt =dp/dt2) 测定方法： 酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速、简便，准确。酶活力测定主要包括两个阶段:其一，酶与其作用底物反应一段时间； 其二，测定反应液中底物或产物变化的量。酶活力测定的一般步骤：a. 根据酶的专一性，选择适宜的酶反应底物。b. 根据资料或试验结果，确定酶促反应条件。c. 在适宜条件下，进行酶反应，记下反应时间。d. 反应一定时间后，终止反应，立即测定产物的生成量或底物的减少量。终止酶反应的方法有：反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活； 立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活；加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH,从而终止反应； 将取出的反应液立即置于冰粒堆中，或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至oC以下测定反应液中物质变化量的方法： 光学检测法：如：用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸(NPP)水解生成的对硝基酚的量。 化学检测法： 如：用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量。3酶活力单位 酶活力的大小，可以酶活力单位表示。(1) 1961国际酶学委员会规定：在25OC,各种最适条件下，一分钟内转化一个微摩尔底物所需的酶量为一个国际酶活单位(IU)。(2) 1972年，EC又推荐了一个新的酶

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