组蛋白转甲基酶Smyd2通过抑制IL

1、组蛋白甲基转移酶Smyd2通过抑制IL6和TNF a的产生负调控 巨噬细胞的活性 背景：巨噬细胞在生长和分化中表达 Smyd2。结果：Smyd2抑制巨噬细胞产生IL6和TNF a。 结论：Smyd2负调控M1巨噬细胞的极化。意义：这个发现对于理解巨噬细胞分化的调控具有重要意义，同时也 为自身免疫疾病的治疗提供了新的视角。SET和MYND结构域2 (Smyd2),是组蛋白H3K4和H3K36特定 甲基化转移酶，在心脏发育和肿瘤发生中发挥重要作用。然而， Smyd2 在免疫和炎症中的作用却鲜少报道。在此研究中，我们发现 Smyd2 负调控巨噬细胞的激活和M1型巨噬细胞的极化。升髙Smyd2的表达, 包括 IL6 和 TNF 在内的促炎因子的表达则会受到抑制，同时，主要的 MHC II和共刺激分子等重要细胞表面分子的表达也会受到抑制。髙 表达Smyd2的巨噬细胞上调TGF B的表达并下调IL6的分泌，从而 抑制Th17细胞分化，促进T细胞的分化。在巨噬细胞中，Smyd2特 定地促进 Tnf 和 Il6 基因启动子上的 H3K36 甲基化，抑制这两种因子 的转录同时抑制NF k B和ERK信号

2、通路。我们的数据证实，在炎症 中，Smyd2调控Tnf和I16启动子上H3K36二甲基化的表观遗传调控 在调节巨噬细胞的活性中发挥重要的作用。固有免疫是人体抵抗细菌、病毒、寄生虫和真菌的第一道防线。 当机体抵御外界病原菌时，固有免疫首先被模式识别受体激活。模式 识别受体由免疫细胞表达，识别与感染病原体有关的病原相关分子模 式。Toll样受体（TLRs）是一类典型的模式识别受体，它们能促进巨 噬细胞和其他吞噬细胞识别入侵的病原体，并且诱导免疫应答，产生 促炎因子和趋化因子。TLRs诱导多种信号通路，如NF kB、MAPK通 路，并能激活NF kB、ERK、p38、eJun等一系列转录因子和激酶。 这些转录因子协同促进多种下游基因如TNF和IL6的表达，最终激活 巨噬细胞。以解剖位置和功能表型为依据，巨噬细胞可分为多种亚型。定位 于特定组织中的巨噬细胞有破骨细胞，肺泡巨噬细胞，组织细胞和库 佛细胞。若以巨噬细胞的功能表型为依据，巨噬细胞可以分为经典方 式活化的巨噬细胞（M1）和选择性通路活化的巨噬细胞。M1型巨噬 细胞产生大量的炎性细胞因子，其中包括TNF a和IL6等，并在清除 各种病原

3、菌和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。M2型巨噬细胞，具有抗 炎特性，在伤口愈合、组织修复、血管生成、肿瘤发展和寄生虫感染 的免疫应答中发挥重要作用。当有病原菌或相关的细胞因子的刺激时 巨噬细胞的活性和基因表达谱均有显著改变，且这些变化由基因、表 观遗传和转录严格调控。巨噬细胞识别和功能的紊乱可能导致克罗恩 病、类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性肝炎等慢性炎症或 自身免疫性疾病。越来越多的研究表明，表观遗传调控在巨噬细胞激活和功能性分 化中起重要作用。真核染色体的基本单位核小体，由四个核心蛋白 （H2A，H2S，H3，H4）包裹146bp的DNA片段组成。基因表达可由 组蛋白翻译后修饰严格调控。这些修饰包括甲基化、乙酰化和磷酸化。 异常的组蛋白修饰与多种人类疾病密切相关，同时也是一些炎症性或 自身免疫性疾病的生物学诊断标志和治疗靶点。组蛋白赖氨酸甲基化 是一个典型的翻译后修饰，包括H3K4、H3K27、H3K36甲基化。H3K4 的三/二甲基化和H3K36的二甲基化与转录基因的激活有关，无论是 H3K36的二甲基化还是H3K27的三甲基化都与相应基因的沉默有关。 有报道称组蛋白赖氨酸甲基

4、化在巨噬细胞的极化和激活中发挥重要 的作用。也有文献报道H3K27的去甲基转移酶Jmjd3在M2型巨噬细 胞的激活中发挥重要作用。而另一篇文献却报道在LPS诱导激活的巨 噬细胞中，有一个保守的SET结构域的H3K4组蛋白甲基转移酶Ashll 调控IL6和TNF a的生成。SMYD家族包含五个甲基转移酶，命名为Smyd15。该家族包含 一个SET结构域，且被MYND结构域分为两个片段。文献报道，在肿 瘤细胞增殖和心肌细胞成熟中 Smyd14 发挥重要的作用。在 HSP90a 缺失的情况下，赖氨酸甲基转移酶Smyd2，二甲基化H3K36，从而抑 制基因的转录。然而，在HSP90a存在的情况下,Smyd2转甲基给H3K4, 使基因转录。另外，Smyd2不仅仅使组蛋白甲基化而且也能使非组蛋 白甲基化。例如，肿瘤抑制因子p53赖氨酸370位点的甲基化使它的 功能受损，且视网膜母细胞瘤蛋白赖氨酸860位点甲基化会使它的靶 基因受抑制。一个最近的研究阐释免疫系统的细胞表达Smyd2。然而, Smyd2在调控免疫应答和炎症反应中的作用仍未知。我们最初观察得到当LPS刺激巨噬细胞激活时，Smyd2的表达

5、显 著地下调，也就是说 Smyd2 负调控巨噬细胞的活性。我们的研究也 证实了我们最初的。这证明 Smyd2 在巨噬细胞激活中是一个负调控 因子。我们发现在原始巨噬细胞中，过表达的Smyd2可抑制TNF-a 和IL-6的表达。且数据表明Smyd2通过抑制H3K4的三/二甲基化， 促进H3K36的二甲基化作用来调控TNF-a和IL-6的生成。另外，过表 达的Smyd2降低NF-KB的活性，诱导RelA结合在靶基因的启动子片 段上。重要的是，改变巨噬细胞中Smyd2的表达，可有效调节T细 胞（Treg）和Th-17细胞的分化。因此，我们的研究对于理解巨噬细 胞分化的调控具有重要意义，且为自身免疫性疾病的治疗提供新的角 度。实验步骤动物中国科学院上海实验动物中心购买C57BL/6小鼠。小鼠被保 存在无病原体的微振笼中，并且所有的实验小鼠均在6-8周龄。所有 的动物实验均被苏州大学实验室动物护理和使用机构批准。 巨噬细胞分离培养-收集小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，在巨噬细胞分化 培养基中培养培养基的成分为：RPM11640（lnvitrogen）, 10%FBS， 100单位/ml青霉素，100单位

6、/ml链霉素，并添加100ng/ml集落细胞共 刺激因子，细胞以2x106/ml （6孔板）的密度培养6天，且培养基在第 三天更换。培养6天后，收集贴壁细胞并转染，24h后收集细胞并用 100ng/ml LPS刺激巨噬细胞激活。T细胞提纯用CD4分离试剂盒纯化CD4+T细胞。用FACS进一步提取 CD+CD25-T细胞，细胞的纯度大约为95%。T细胞和巨噬细胞的分化与培养在i Treg细胞分化 (rhTGF-Bl,3ng/ml )或 Th-17 细胞分化 (IL-6,10ng/ml;rhTGF-Bl,3ng/ml;anti-IL-4,10口g/ml;anti-IFNY,10口g/ml) 的条件下，用CD3(3yg/ml)和CD28(2yg/ml)的抗体刺激纯化的CD4+CD25-细胞。并分别用Smyd2质粒或者对照组突变型质粒以1 ：1 的比例转染巨噬细胞并培养3到4天。质粒转染Smyd2质粒(批号no.MC204022)和对照组质粒(批号 no.PS100001)购至0riGene。构建Smyd2点突变的突变型，引物为： 5CGAGGTGTTCACCAGCTTCATCGACCTGCT

7、ATATCC;3GGATATAGCAGGTCGATGAAGCTGGTGAACACCTCG。如前所述构建116和Tnf荧光报告基因质粒oPgl3荧光对照质粒和内参TK 质粒购自Promega。用Il6(5-CCTCTAGATAGTGCGTTATGCCTAAGCA-3;5 CCTCTAGAGTTTGAAGACAGTCTAAACAT-3，)和Tnf的弓I物构建 报告基因。所有构建的报告基因均用DNA测序验证。用小鼠巨噬细胞 核转染试剂盒进行巨噬细胞转染。RNA干扰特定的小鼠Smyd2小干扰RNA1,在目的基因中加入SMART缺陷的鼠Smyd2 (catalog no.226830)。乱序的RNA对照购自 Dharmacon。另一个特定的Smyd2小干扰RNA2购自Santa Cruz Biotechnology。用小鼠巨噬细胞核转染试剂盒转染siRNA双螺旋。 实时定量PCR用RNA提取试剂盒(Qiagen)从细胞中提取总RNA, 然后用逆转录试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA,然后用ABI 7900HT(Applied Biosystems)实时定量PCR来检测基因的表达。其中，PCR所

8、用 的特定引物为：鼠 Smydl, 5-TCAGTGACCAGAGAGGGCTAC-35-AGCTCAATCTTGCCATTGTTGAA-3 ；Smyd2, 5-ACTGCGACGTGGAATGTCAG-35-CGCACAGTCTCCGAAGGAT-3；Smyd3, 5-CCGACCCCTTGGCTTACAC-3 5-CGGCATTGAGAACAACGCATC-3 ；Smyd4, 5-GGTGGATGAATGGAAGTCCTACC-3 5-CCTCAGGTTGAAGAAGGGAAGAA-3；Smyd5, 5-GGCACCCCCTCAATAAGCTG-35-ACCCAGTGGTCCTTGTCCTT-3；IL-6, 5-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-35 -TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3;TNF-a, 5-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-35-GCTACGACGTGGGCTACAG-3；B-actin, 5-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3 5-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3。Wes tern Blo 用包

9、含PMSF和蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀缓冲 液裂解细胞。SDS-PAGE分离裂解混合液，并通过蛋白免疫印迹分析。所用抗体Smyd2, phospho-IKKa/B，IKKa/B，phospho-lKBa, iKBa,phosphop65, p65, phospho-ERK1/2, ERK1/2, phospho-p38, p38, phospho-c-Jun和c-Jun均购自信号转导公司。抗-B-actin抗体购自 SigmaAldrich。富士las4000发光成像仪曝光作用化学发光底物的印迹， 并用Image J软件绘图(国立卫生研究院)。ELISA从R&D公司购买ELISA试剂盒检测培养基上清中，细胞产生 的TNF-a, IL-6和IL-17等细胞因子的水平。荧光素酶报告基因表达的分析指示剂pGL3-luciferase报告质粒与Prl-tk-Renilla-luciferase 质粒(内参)共转染 RAW264.7 巨 噬细胞，并检 测Smyd2和内参的表达。转染24h后，LPS刺激细胞。双荧光素酶报告 系统检测荧光素酶的活性(Promega)。荧光素酶检测实验确定荧光 素酶活性，从而确定转染效率，统一数据。与对照组，实验组的比值 成倍增加。CHIP实验购买CHIP试剂盒(Millipore)，按说明书进行CHIP实验。 实时定量PCR分析免疫沉淀DNA和内参DNA，用内参DNA来标准化结果。ChIP 所用抗体, Smyd2(catalog no.ab108217), H3K4me2 (catalog no. ab7766), H3K4me3 (catalog no.ab12209),H3K27me3 (catalog no. ab6002),和H3K36me2 (catalog no. ab9048)均购自 Abeam。ChIP试剂盒 EZ-ChIPTM (catalog no. 17-371)购自 Millipore.以下启动子引物被CHIP 实验放大：Il6，5-GAA

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