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碱性蛋白酶活力测定

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卖家[上传人]：汽***

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1、碱性蛋白酶活力测定1定义1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1g酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g （u/mL）表示。2福林法2.1原理碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。2.2试剂和溶液2.2.1福林酚试剂已配2.2.2 碳酸钠溶液 c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na CO）21.2g，用水溶解并定容至500mL。232.2.3 三氯乙酸（CCl3COOH） =0.4mol/L称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。2.2.4 氢氧化钠溶液 c（NaOH）=0.05mol/L按GB601配制。2.2.5硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。上述缓冲溶液，需用pH计校正。

2、2.2.6 10g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。2.2.7 100Pg/mL L-酪氨酸标准溶液a. 称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用 1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b. 吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100Pg/mL L-酪氨酸标准溶液。2.3仪器和设备2.3. 1 恒温水浴（400.2）C2.3.2分光光度计应符合GB 9721的规定。2.4分析步骤2.4.1标准曲线的绘制a. L-酪氨酸标准溶液按附表1配制。表1 L-酪氨酸标准溶液管号L-酪氨酸标准溶液的浓度c/（Pg/mL）取100四g/mL酪氨酸标准溶液的体积V/mL取水的体积V/mL0001011019220283303

3、74404655055b.分别取上述溶液各1.00mL （需做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液 5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL，置于（400.2）C水浴中显色20min,取出，用分光光度计与波长680nm, 100mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（四g），即为吸光常数K值。其K值应在95100范围内。2.4.2测定酶液制备：精确称取十酶粉1g （0.001），加入10mL缓冲液（2.2.5），在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静置片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲液定容至刻度，充分摇匀，用四层纱布过滤。吸取滤液5mL，移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液位稀释2000倍的酶液。（稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活）a先将酪素溶液放入（400.2）C恒温水浴中，预热5min。b.按下列程序操作：试管A（空白）|试管B （酶试样，需做3个平行试样）!加酶液1.00mL加酶液1.00mL|(400.2)C, 2min加三氯乙酸2.00mL(摇匀)I(400.2)C, 2min加酪素1.00mL (摇匀)I (400.2)C, 10minI(400.2)C, 10min加酪素1.00mL （摇匀）I离心（5000r/min,5min）I取1.00mL滤液I加碳酸钠溶液5.0mLI加福林试剂使用液1.00mLI于680nm波长，用10mm 比色皿测其吸光度加三氯乙酸2.00mL（摇匀）I离心(5000r/min,5min)I 取1.00mL滤液I加碳酸钠溶液5.0mLI加福林试剂使用液1.00mL广于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度2.5计算X=AXKX4/10Xn=2/5XAXKXn式中X-样品的酶活力（u/g或u/mL）A-样品平行试验的平均吸光度K-吸光常数4-反应试剂总体积（mL）10-反应时间10min,以1min计n-稀释倍数所得结果表示至整数。2.6思考题实验过程中添加三氯乙酸的作用？

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