第十六章 标记抗体技术
13页1、第十六章 标记抗体技术1、免疫荧光标记技术的概念 /所用荧光素的要求 /基本原理 /操作步 骤/注意事项/实际应用(一)概念:免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记, 然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法(二)荧光素要求:作为蛋白质标记用的荧光素须具备 有与蛋白 质分子形成稳定共价键的化学基团,而不形成有害产物 荧光效率 高,与蛋白质结合的需要量很小结合物一般在储存条件下稳定, 结合后不影响抗体的免疫活性作为组织学标记,结合物的荧光必 须与组织的自发荧光有良好的反衬,以便能清晰地判断结果 结合 程序简单,能制成直接应用的商品,可长期保存。可用于标记的荧光 素有FITC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。-件为标记蔬光素需椭足的条件;(1)有与蛋1分子形成穗定共价键的化学基团.且不形成有嘗产物.C2)荧光效军高.与蛋白结合的需要垦小.(3)标记后不欝响抗体的洒性(4)怖质稔定,易保秤(5)谶发的荧光与背景颜色有良好的反差-标记简单.能花成商品(三)基本原理:将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反 应(四)操作步骤:标本制备: 涂片或压印片:细菌培养物、
2、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、 尿沉渣冰冻切片或低温石蜡切片:组织学、细胞学和感染组织 盖玻片:上面培养单层细胞 首要要求是保持抗原的完整性,并尽可能减少形态变化,抗原位置保 持不变。标本要相当薄,有适当的固定处理方法 固定:常用丙酮和95%乙醇,室温固定15-30min后,用PBS反复 冲洗,干后即可染色。目的:防止被检材料从玻片上脱落,消除抑制抗原抗体反应的因素。 检测细胞内的抗原,用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于 荧光抗体渗入。 检测:A、直接法:直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区,置湿盒中,于37度染色30min左右,然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min,干 燥、封载,显微镜镜检B、间接法:将标本先滴加特异性的抗血清,置湿盒中,于37度作用30min, PBS漂洗5min后,再加入FITC标记的抗抗体,置湿盒中,37 度作用30min,PBS漂洗5min,干燥、封载,显微镜观察(3)集色方法有直接迭和间按法两种宜接姑;A在标本上滴加加舲单位的标记抗休、置湿盒 中,37C作用30H1HB在犬量PBS中漂15min.D封诚商加緩冲甘油.用益跋片封養 检测
3、中.要设阳性、阴性标本对照 缓冲甘油:分析纯甘油驸加FBS1份直接弦猪链竦菌理MRF的雅宦r措链球曲2型肉汤培养物涂片 s-r-B PBS漂洗 5 minC拥人FTP茴工的抗MRP抗怵,理視盒中,冬尹C作用30 mnD PBS漑洗5 ninE干燥、封载M间接法(如检测猪淋巴结甲ffiSFVA在标本上滴抑抗SFV血清.置湿盒中.37C祚用30 minB PBS臟 5 mittC抑FITG标记的抗抗体.置湿盒中,歹C作用30 minD PBS漂恍E干燥、封載(五)注意事项: 由于荧光容易淬灭,一般仅能维持几个小时,因此,荧光二抗应 避光保存,即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片 后应尽早照相,目前有市售的荧光增强剂,可使荧光在4 度保存1-2 周仍不淬灭 常用的荧光素有以下几种:绿色荧光:FITC,Alexa Fluor488和GFP; 红色荧光:TRITC,Cy3, Alexa fluor568&594 和 MitoTrackerRed;蓝色荧 光:Hoechst, DAPI;黄色荧光:YFP,Fuo-3 和 Rhoda-mine123 不同的荧光素激发的波长不同,因此,选
4、用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm,蓝光的激发波长为435-490nm,绿光的激发波长为546nm左右 荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热,关闭30min后方可再开启 免疫荧光的组织要求很高,载玻片即盖玻片要干净无杂质(六)实际应用:(1)细菌学诊断可直挽楡測威鹿定新井离的细SL具育 较髙的敏感性和特异性-动物粪便.黏膜拭子涂片、病变组织触 片或切片、尿沉渣等均可作为样本对含菌少的样半,可采用滤膜聚曲迟 擁后在滝膜上竝行免疫蔬光染酋(2)病毒病诊断出接检側病变齟垠巾的病弗是病奇炳燼 断的常用手段.如猪温.禺件支猪流行性腹泻和传染性冒肠炎,临床症状 相似,但将猪小肠做切片.即可区分对于诸瘟等不出现细脳病变的病毒卜免疫 荧光可作为病毒增殖的指征(3其地应用免疫黄光广抚应用于淋巴细胞CD分子和般表 面免疫球蛋白的检测.用于淋巴细脳的分型; 借助于流式细廳计数技术,可以评价机体细胞 免蛙忧良如咗捌刺徼机怵细起免疫功憶增加, 可通过檢上的口玻达虽来連真2、放射免疫分析的概念/所用放射性元素要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用(一) 概念:是将放射性同位素测
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