免疫细胞检测技术

1、免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包 括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、 肥大细胞等。各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中 的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参 与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉 以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有 一定意义。本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测 三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。一免疫细胞的分离免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。 它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是 分离各种免疫细胞的基础。细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的 大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞 膜表面的蛋白质（表面标记）来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的 受体等。根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离 出来。免疫细胞

2、分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于 细胞表面标记的分离方法。基于细胞物理性状的分离方法（一）根据各种细胞比重的差异1. 自然沉降法2. 密度梯度离心法人外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比 重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.00 左右，而淋巴细胞 和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用密度在 l.077 万0.001 之间近于等渗的 Ficoll-Hypque 混合溶液（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分 将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上 部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层 液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o （如图1-1所示）图 1-1 淋巴细胞分离示意图3. 改变细胞密度法巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T 细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心 将 T 细胞分离。（二）根据细胞吸附特性 巨噬细胞能够非特异性粘附于玻璃或塑料表面，根据

3、这种特性可以将巨噬 细胞从混合细胞群体中分离 ;B 细胞能够粘附于尼龙棉上 .通过尼龙棉柱时被阻 滞，从而将其与其他细胞分开。（三根据细胞对渗透压变化的敏感度 倒如红细胞对低渗敏感.通过低渗处理能够裂解红细胞。基于细胞表面标记的分离方法（一）补体细胞毒分离法 采用特异性抗细胞表面标记的抗体，结合具有该表面标记的细胞，在补体的 作用下，使具有该表面标记的细胞发生溶解，将其从混合细胞群体中去除。二免疫磁珠分离法磁性微珠是上世纪80年代初以高分子材料和金属离于（如Fe3O4）为原料聚合 而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁 性微珠。在班液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微 珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 免疫磁性微珠主要用于细胞的分离和纯化，其基本原理及步骤是:首先将抗特异 细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力 的作用，便与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。通 常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离 出靶细胞，

4、阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。免疫磁珠分离细胞方法简便，快速，无需特殊的设备，且分离纯度高，产率 大，近年来已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T、B淋巴细胞、内皮细胞、 造血祖细胞、单核/巨噬细胞及胰岛细胞、多种肿瘤细胞等。近年来，人们又开发出与生物素结合的单抗亲和素/链霉亲和素-生物素结 合的磁性微珠的实验方法，这种方法旨在利用生物素-亲和素间的高亲和力和生 物放大作用来增强磁性微珠与细胞的结合力，从而提高细胞的分离效率。为了对 细胞分离效果迅速进行分析，可将荧光素（如FITC）标记在亲和素/链毒亲合素表 面，使所分离的细胞在流式细胞仪（FCM）上立即得到测定分析，从而省去了免疫 荧光染色的时间。三流式细胞术流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系 统和细胞分离纯化系统组成。（其基本构成框架见下页图 1-2）其工作原理及特点为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下 同时进行流室，形式鞘液包裹细胞悬液的稳定层流，由喷嘴高速射下（1000-5000 个细胞/s）与垂直而来的激光束交汇。在混合细胞中，由于细胞大小、胞内颗拉多 少及DNA

5、含量等不同，使激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受;细胞 上着染的荧光染料在激发光激发下，发射出荧光，由荧光检测器接受，所有信号 自动传入电子计算机分析处理，迅速藐测得细胞类群及其数量的信息。由高颇超 声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统，在分析鉴别不同的细胞类群 的基础上，使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离，最后将细胞分别收 集于不同容器内。图 1-2 流式细胞仪组成示意图流式细胞术（FCM）是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒（如细菌） 等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光 学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理 论与临床应用研究。将荧光标记的单克隆抗体加人 PBMC 悬液内，使二者特异性结合，通过流式 细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据, 又能以每非高达 5000 个细胞的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达 90%-99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。免疫细胞功能的检测第一节 免疫细胞数量的检测一、通过检测表面标志（

6、CD分子）检测各类免疫细胞的数量免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及及活化过程中，其细胞膜表面 均表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。其中CD分于常作为各类免疫细胞的 表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离以及用于检测在不同状态下某类免疫细胞 含量的变化，能够反映机体免疫功能状态，有助于研究某种疾病的发病机制，为 疾病的诊断和治疗提供依据。一免疫荧光染色技术利用荧光素标记抗人T细胞亚群的单克隆抗体（McAb）直接与人淋巴细胞反 应；或用际记有荧光素的羊（或兔）抗鼠IgG作为第二抗体，再借助McAb的介导 与人淋巴细胞结合。在荧光显微镜下，结合有荧光素标记抗体的细胞在黑暗背景 下发出黄光，凡是呈现特异性黄光的细胞即为阳性细胞，计数阳性细胞，从而确 定 T 细胞各亚群的百分率。上述方法分别称为直接免疫荧光法和间接免疫荧光 法。二）微量细胞毒试验在补体存在的情况下，针对淋巴细胞CD分于的McAb与相应的CD分子结 合，可将细胞杀死，其细胞膜失去屏障作用而使伊红染料透入细胞内，使之染呈 红色。而无相应CD分于的细胞则不受损伤，因而不着色。计数死亡细胞数，即 可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，

7、从而确定T细胞的亚群。该方法简便 易行，准确性较高。（三）红细胞花环法采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞（SRBC）结合，制成致敏 的SRBC o抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞 周围形成花环。通过计数花环形成率，从而确定 T 淋巴细胞各亚群。该方法可 分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。四免疫酶染色技术（ABC法）抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下 是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复 合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。免疫酶染色技 术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等 ）标记已知抗体（或抗 原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存 在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分于遇到底物时，能催化底物水 解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。该方法具有敏感 性高，标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就观察等优点。但有时也存在 非特异性染色影响。其基本的方法是将亲和素与酶标生物素反应

8、形成复合物 （ABC）,再与生物素化的第二抗体反应，借助与T细胞反应的抗人T细胞亚群的 McAb（第一抗体）介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。（五）流式细胞术前面已经有所介绍，流式细胞术（FCM ）是一种高速度、高灵敏性、高精 度和高分辨率的自动分析细胞的高新技术。主要用于定量分析单细胞表面、细胞 内抗原和对分子水平的核酸含量的测定。二、抗原特异性T细胞数量的检测一 MHC/多肽四聚体法T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的MHC/抗原肽复合 物后，被活化和发生增殖，进而分化成效应细胞。因此，可以用 MHC 抗原肽/ 复合物检测T细胞表面的特异性TCR,来反映抗原特异性T细胞数量的变化。Altman等首次发明MHC/多肽四聚体方法并应用于检测可识别HIV抗原肽 的特异性CTLs,获得成功。后经Walter等改进，成为检测和研究抗原特异性T 细胞数量和功能的新技术。可溶性MHC/多肽四聚体方法敏感性高，克服了传统 方法的局限性，可用于各种抗原特异性 T 细胞表型分析、分离和克隆化，也可 用于检测抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞数量，为研究与细胞免疫反应有关的

9、一系列工作提供了高效、快速、敏感的研究手段。其基本方法是将体外表达的 MHC 重、轻链分子及短肽共孵育，使其折叠成 正确的构象，形成MHC/多肽复合体，再经过纯化，并借助于半胱氨酸的巯基与 生物素结合，然后将一个标记荧光的链章含亲和素与 4 个生物素标记的 MHC- 肽复合体结合形成四聚体。这种MHC多肽四聚体与抗原特异性T细胞上的TCR 结合后，即可通过灵敏度很高的流式细胞仪(FACS)进行检测。第二节 T、B 淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。体内主要是进行迟发型超敏 反应.借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的反应；体外试验方 法包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原的增殖试验、细胞毒试验以及其分泌产物功 能的测定。淋巴细胞功能测定不仅能够了解机体免疫功能状态 .而且是免疫缺陷 诊断断的主要依据，也有助于探讨某些疾病的发病机理、疗效判断、推断转归。 一、T、B淋巴细胞增殖反应测定淋巴细胞体外增殖反应是检测细胞免疫功能的常用方法。剌激淋巴细 胞增殖的物质可分为二大类:非特异性剌激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、佛波酶(PMA)等有丝分裂原;能产生A蛋白的葡萄 球菌(SAC)、EB病毒、链球菌溶血毒素S、细菌脂多糖(LPS)等微生物及其代谢 产物;胃蛋白酶、膜蛋白酶等蛋白物质;抗CD3、CD2、IgM等细胞表面标志的抗 体以及某些淋巴因子等;特异性剌激物:主要是特异性抗原物质，包括各种可溶 性抗原和细胞表面抗原。不同的剌激因子可剌激不同的淋巴细胞分化增殖，因而 可反映不同淋巴细胞群体的免疫功能。体外测定淋巴细胞增殖反应常采用同位素 掺入法和 MTT 比色法。(一)3H-TdR掺入试验 淋巴细胞受特异性抗原或有丝分裂原剌激后，在转化为淋巴母细胞的过程 中.DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈正相关，此时若将合 成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素(3H-TdR)标记，加入到培养体 系中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺人DNA分子内。培养终止后，测定淋巴细 胞内掺入的3

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