基因工程和基因重组

1、第十四章基因重组和基因工程一. 自然界DNA重组和基因转移是经常发生的。1. 同源重组是最基本的DNA重组方式：发生在同源序列间的重组称为同源重 组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接， 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。2. 细菌的基因转移与重组有四种方式：接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个 细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转 移称为接合作用。转化作用：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细 胞获得新的遗传表型，称为转化作用。转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供 体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。3. 位点特异重组，即特异位点间发生的整合：位点特异重组是由整合酶催化， 在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。入噬菌体DNA的整合:入 噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异 靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病 毒cDNA的长末端重复序列。细菌的特异位点重组。免疫球蛋白基因的重排:

2、免疫球蛋白，由两条轻链和两条重链组成。重链基 因的V-D-J重排和轻链基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的 下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列（RSS）。 此重排的重组酶基因rag共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。4. 转座重组：大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一 个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。插入序列转座：插入序列（IS）由二个分离的反向重复（IR）序列、特有的正 向重复序列、一个转座酶编码基因组成。插入序列发生转座的形式为保守 性转座、复制性转座。转座子转座：转座子一可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序 列。由反向重复序列、转座酶编码基因、抗生素抗性等有用的基因组成。二. DNA克隆：1. 克隆:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克 隆化，即无性繁殖。2. DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异 源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有 自我复制能

3、力的DNA分子一复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选 出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA分子， 也称分子克隆、基因克隆或重组DNA。3. 基因工程：（genetic engineering）:实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。三. 工具酶：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶I、逆转录酶、T4 DNA连接酶、碱 性磷酸酶、末端转移酶、Taq DNA聚合酶。1. 限制性核酸内切酶（RE）:识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶。根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰 活性等，一般将限制酶分为I（不适用于基因工程，识别回文结构），11（基 因工程的工具酶），111（对分子克隆操作亦无实用意义）三大类。与甲基化 酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。2. 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。3. 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的 粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。四. 目的基因：1. cDNA

4、:经反转录合成的、与RNA （通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。以 单链c DNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。2. 基因组DNA:代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有 DNA序列。五. 基因载体：携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的 一些D NA分子。常用质粒DNA、噬菌体DNA、病毒D NA。1. 克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。2. 表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体 称为表达载体。3. 选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和 鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多 克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。4. 质粒：存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。具有自我复制功能。带有 抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。5. 入噬菌体：可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的入 DNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用入载体；不少先进的 质粒应用

5、入组件进行构建。6. 其他：酵母人工染色体、细菌人工染色体、动物病毒DNA改造的载体。六. 重组DNA技术基本原理：目的基因的获取；外源基因与载体的连接；DNA导 入受体细胞；克隆载体的选择和构建；重组体的筛选；克隆基因的表达。七. 目的基因的获取。1. 化学合成法：要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2. 基因组DNA文库（genomic DNA library）法：基因组DNA文库一存在于转化 细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。3. cDNA 文库（cDNA library）法。4. 聚合酶链反应（PCR）法。八. 克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建 方法也不同。为目的基因提供进入受体细胞的转移能力；为目的基因提供在 受体细胞中的复制能力或整合能力；为目的基因提供在受体细胞中的扩增和 表达能力。九. 外源基因与载体的连接：1. 粘性末端连接：同一限制酶切位点连接，不同限制酶切位点（非配伍末端） 的连接。2. 平端连接：适用于限制性内切酶切割产生的平端，粘端补齐或切平形成的平 端。3. 同聚物加尾连接:在末端转移酶的作用下，

6、在DNA片段末端加上同聚物序列、 制造出粘性末端，再进行粘端连接。4. 人工接头连接：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端， 而进行粘端连接。十.重组DNA导入受体菌：受体菌条件为安全宿主菌，限制酶和重组酶缺陷，处 于感受态。导入方式为转化、转染、感染。十一.重组体的筛选：1. 直接选择法：抗药性标记选择（插入失活法）；标志补救（a互补）；分子杂 交法-原位杂交，Southern印迹。2. 免疫学方法：如免疫化学方法及酶免检测分析等。十二.克隆基因的表达：表达体系的建立包括表达载体的构建，受体细胞的建立， 表达产物的分离纯化。1. 原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）：选择标志一强启动子，翻译调 控序列-多接头克隆位点。不足-不宜表达真核基因组DNA；不能加工表 达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶 性蛋白。2. 真核表达体系：优点-可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA，可适当修饰 表达的蛋白质，表达产物分区域积累。缺点-操作技术难、费时、经济。 转染一将表达载体导入真核细胞的过程。方法-磷酸钙转染；DEAE葡聚糖 介导转染；电穿孔；脂质体转染；显微注射。十三.疾病基因的发现与克隆：根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病 的分子机制。十四.生物制药：利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今 世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。十五.基因诊断：利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、 鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断。过 程为分离、扩增待测的DNA片断，区分或鉴定DNA的异常。能正确扩增靶基 因；能准确区分单个碱基的差别；本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定；便于 完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。十六.基因治疗：向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基 因的缺陷，从而达到治疗的目的。包括体细胞基因治疗，性细胞基因治疗。十七.遗传疾病的预防：产前诊断，携带者测试，症候前诊断，遗传病易感性。

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