毕业设计（论文）柏树内生真菌的分离与抑菌研究

1、摘要植物内生真菌作为生活在植物组织内部的一大类微生物，在其生活史的一定阶段或全过程中队宿主不表现出明显病症。在长期共同进化过程中，植物内生菌与宿主植物之间形成了一种共生关系。香柏和罗森绘具有天然的抗白蚁特性，按照基因可互相传递的原则推测，香柏的内生菌可以产生对白蚁有抑制作用的活性物质。因此本实验旨在从具有天然抗白蚁树木的树枝、树皮中分离出能抗白蚁的内生真菌。利用白蚁体内共生菌作指示菌，采用牛津杯法做抑菌试验，得到抑菌功能效果好的菌株HDF-I-217和HDF-I-232。下一步将对该两株菌进行鉴定，提取其代谢产物用于防治白蚁，这将具有极大的开发利用价值。关键词 内生真菌 白蚁 分离1目 录摘要11.前言11.1植物内生真菌11.2 植物内生真菌研究现状及应用11.3 白蚁及白蚁的危害31.4 白蚁的防治51.5 本实验研究的目的及意义72.材料与方法72.1材料及设备72.2试验方法83结果与分析103.1柏树木内生真菌的分离104.讨论125结论136.参考文献147.致谢15附录161.前言1.1植物内生真菌1.1.1内生菌概念对内生菌的定义认识是不断发展的。首先由Be Bary提

2、出，内生菌是指生活在植物组织内的微生物，以区分那些生活在植物表面的表生菌（Epiphyte）；后来Carroll将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌，突出强调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，这个内生菌概念不包含植物致病菌和菌根菌1。目前，内生菌概念是由Stone等提出的，是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物（至少暂时）不表现出围在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来注明其内生2。也就是说我们可以把植物内生菌理解为生活于植物组织内的正常菌群，不仅包括互惠共利的内共生微生物，也包括潜伏在宿主植物体内的病原菌3。1.1.2植物内生真菌植物内生菌主要有细菌、真菌和放线菌。内生真菌（Endophytic fungi）是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。近年来的研究表明，内生真菌可以产生与宿主相同或相似的代谢产物。植物与内生真菌呈互利共生的关系：一方面，植物为内生真菌提供光合产物和矿物

3、质；另一方面，内生真菌产生的代谢物，或能刺激植物的生长发育，或能提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力。这些代谢物中的一部分，正是应用前景广阔的新型生物活性物质，有很高的开发利用价值4。1.2 植物内生真菌研究现状及应用内生真菌广泛存在于健康植物组织内部，是植物微生态系统的重要组成部分。内生真菌产生的各种活性物质，在生物制药、农业生产、工业发酵的方面都表现出美好的应用前景，受到世界各国专家的广泛关注。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足人们日益增长的需求；同时又利于珍稀、濒危要用植物资源的保护，对减少野生药用植物多样性的破坏具有重要意义。药用植物具有丰富的物种多样性，是人类生存与发展的重要自然资源。各种药用植物中蕴藏着非常丰富的内生真菌。通过与药用植物的“协同进化”，某些内生真菌具有了产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力。1.2.1 抗肿瘤活性物质 植物中极低的含量和植物资源的有限是人类规模利用这些化合物所面临的主要困难。这造就了从红豆杉等植物中去寻找能产生紫杉醇的内生真菌。从红豆杉的内生真菌中不仅分离出了紫杉醇，现已从红豆杉及其

4、近缘植物分离到了许多种产紫杉烷类化合物的内生菌。落羽松（Taxodium distchum）、榧树（Torreya grandifolia）、银杏（Ginkgo biloba）、秃柏（Toxodium distichum）以及一种松树（Wollemia nobilis）中都分离到了能产生紫杉醇的内生菌，这为紫杉醇的来源问题提供了很好的解决办法5。 以中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）株作为模型，对喜树内生真菌此生代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验，结果表明从喜树的树皮和树枝中均分离了能产生抑制CHO细胞增殖活性的内生真菌6。郭智勇等7从三种红树林内生真菌Paecilomyces sp.(treel-7),4557,ZZF65中分到九个环肽类的次级代谢产物，其中得到的环Pro-Leu具有强的抗癌活性及特殊的抗菌活性而被称为灭癌素。1.22 抗菌活性物质多种药用植物本身具有抗菌消炎作用，因此其内生真菌也是筛选抗病原菌菌株的理想途径，已有多种药用植物内生真菌被研究过抑菌活性。从黄花夹竹桃分离到的内生真菌中有17株具有抑菌活性，其中一株木霉（Trichoderm sp.）抑菌活性最强，抗菌谱最广1。W

5、agenaar等8从薄荷的一株内生真菌Phomopsis longicolla的培养物中，分离提取出一种新的抗生素dicerandrols，它具有很强的杀菌作用。目前人们已知的抗生素远不能满足需求，植物内生真菌是一个未开发的新领域，它们所产生的抗生素活性成分往往是新颖的。因此，开发植物内生真菌为寻找新的抗生素提供了具有广阔的前景。1.2.3 产酶的内生菌近年来，关于内生菌产酶的报道越来越多，利用内生菌产生的酶体系经过筛选可用于有机合成、新药开发等领域，是丰富天燃产物的又一新途径。内生真菌产生细胞壁分解酶，用以克服宿主防御异物的天然屏蔽，还能产生果胶酶、纤维素酶、醋酶等胞外酶。有些酶具有较高的商业应用价值。2001年Stamford等人发现从薯蓣属蚕豆中分离出来的内生放射形拟诺卡菌可以产生耐热性-淀粉酶；次年，又发现玉米叶中的内生真菌链孢子囊菌在ph8.0的淀粉-Czapek培养基上可以高效长生耐热葡萄糖淀粉酶9。1.2.4 抗虫抑菌类物质内生真菌可增强宿主对病虫害的抵抗能力，这是因为有的内生真菌在宿主内和纯培养中产生有毒物质，如有机胺类，麦角生物碱等。这些内生真菌的代谢产物可对植物致病

6、菌和有害昆虫产生抗性。国内外关于内生真菌在农药领域的研究与开发尚处于起步阶段，报道极少，因此值得深入研究与开发。从药用植物海金沙中筛选抗小麦霉菌、番茄早疫霉菌、番茄灰霉菌等植物病原真菌的内生真菌，并进行活性物质检测。结果表明80%以上的内生真菌对3种农作物病原真菌具有较强的抗菌活性10。1.2.5 植物生长调节物质内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的生长发育具有哼重要的作用。内生真菌能产生促进植物生长的物质如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。内生真菌也能通过增强植物吸收N、P等营养元素，或与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而间接促进植物生长。研究发现，金线莲等4种兰科药用植物的内生真菌能够产生赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、玉米素（Z）、玉米素核苷(ZR)等植物生长调节剂12。1.2.6 产香气的内生真菌从香料植物香茅草上分离到一株产香内生菌XCX-1，液体发酵后分析鉴定其发酵液的挥发性成分，共鉴定出74个化合物，其中有乙缩醛二乙醇、柠檬烯、月桂烯、月桂醛等多种香料物质。产香内生菌给新的香料资源开发提供了理论依据1

7、3。12.7 生物防治 植物内生真菌的专一性很强，除了对其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外，对其他生物没有直接影响，而且内生真菌还可通过人工接种被导入不同的植物并可通过宿主的种子进行遗传；内生真菌分布于植物组织内，有足够的碳源、氮源，而且受到植物组织的良好保护，具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用，因而具有作为生物农药的优良特性。兰琪等14从苦皮藤（Celastrus angulatus）植株中分离到39株内生真菌，其中3株内生真菌发酵产物的丙酮提取物对番茄灰霉病等6种病菌的菌丝生长有较强的抑制作用。在盆栽试验中，内生真菌发酵产物的丙酮提取物对供试病菌的治疗和保护作用均在50%以上，有的内生真菌在一定条件下可成为桔抗菌。由此可见，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌。但内生真菌提高植物抗病性的机制，以及内生真菌如何影响寄主防御相关的酶系活性还不清楚。1.2.8 其他作用药用植物内生真菌具有一些其他有益的生理作用，如除草活性、抗结核、抗虐、免疫抑制作用、抗氧化、降解纤维素、保鲜等12。1.3 白蚁及白蚁的危害1.3.1 白蚁白蚁属于昆虫纲（Insects）等翅目

8、（Isoptera），是地球上最古老的社会性昆虫，距今大约有2.5亿年的历史。全世界有大约2600种白蚁，我国有500余种。白蚁在分类上的地位和名称经历了100多年的不稳定。从解剖学和社会学组织性特征可以把白蚁分为两大类群，即低等白蚁，包括澳白蚁科（Mastotermitidae）、木白蚁（Kalotermitidae）、草白蚁科（Hodotezmizdae）、原白蚁科（Termopsidae）、鼻白蚁科（Rhinotermitidae）、齿白蚁科（Serritermitidae）、和高等白蚁即白蚁科（Termitidae）共七个科。高等白蚁较低等白蚁有更细致的内外部解剖学特征和更强的社会组织性。低等白蚁吃木质性食物（吃草的草白蚁除外），肠内有原生动物和细菌共生；白蚁科占白蚁总数的75%，吃树、草、凋落物和含矿物质的土壤，有丰富的肠细菌共生，但原生动物很少见15。白蚁作为社会性昆虫的类群之一，低等白蚁与肠道微生物共生是其特征，很多研究者经常选择其作为研究材料。白蚁肠道呈螺旋状，其中存在着原生动物，发酵性螺旋体，同型产乙酸细菌，甲烷细菌和硫酸盐还原菌，它们对白蚁消化木质纤维素类食物有着重

9、要作用16。1.3.2 白蚁的危害作为森林“分解者”，白蚁对森林的物质循环起了很大作用；反之，作为木材害虫，它给人类带来了各种危害。白蚁是喜温性昆虫，只要具备了适宜的温度，温度和食物等条件，就能很快的繁殖，扩散。白蚁的繁殖危害可造成严重的损失，全世界每年直接和间接的损失达数十亿美元。由于白蚁危害的严重性和广泛性而引起了人们的重视。在欧洲，散白蚁（Reticulitermes）造成的财产损失最大，仅法国每年损失就达2亿欧元。在意大利、西班牙、葡萄牙和希腊，白蚁对建筑的侵害也很严重，很多具历史意义的建筑被严重损坏。随着欧洲经济复苏，在5年内，年除害处理费用至少达到10亿欧元。1.3.2.1 白蚁对建筑物的破坏白蚁对建筑物的破坏，特别是对砖木结构、木结构建筑的破坏，由于其隐蔽在木结构内部破坏或破坏其承重部位，往往造成房屋突然倒塌，导致财产损失和人员伤亡，引起人们的极大关注。近年来，随着钢筋混凝土建筑的增多，被白蚁破坏造成倒塌的危险性的比率是在逐步降低。但是，新的大厦内部木结构仍可遭受白蚁破坏。白蚁不仅危害木结构，而且它分泌的蚁酸也可以腐蚀金属。因此，新建房屋必须进行白蚁预防处理。1.3.2.2 白蚁对堤坝的破坏在我国南方诸省、区的堤坝白蚁危害极为普遍，堤坝白蚁主要危害种类是土白蚁属和大白蚁属，在中国有广泛的分布。尤其是长江流域及其以南的江河堤围和山塘水库，普遍遭受白蚁的危害，常常出现蚁患险情和灾难。这些白蚁在堤坝内2-3m甚至更深处，修筑直径达1m以上的巢，密集营巢，蚁到四通八达，有些蚁道甚至穿通堤坝的内外坡。当汛期水位升高时，常常出现管涌、滑坡、垮坝险情。1.3.2.3白蚁对农作物的危害白蚁可能危害花生、木薯、桑、茶、玉米、小麦、水稻等农作物，尤其对甘

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