黄连素调节醛糖还原酶p38MAPK信号通路抗糖尿病肾病研究

1、 中山大学硕士学位论文黄连素调节醛糖复原酶/p38MAPK信号通路抗糖尿病肾病的研究姓名:刘慰华申请学位级别:硕士专业:中西医结合根底指导教师:黄河清20070501中山大学硕十学位论文黄连素调市醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究黄连素调节醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究专业:中西医结合根底硕士研究生:刘慰华导师:黄河清教授摘要糖尿病肾病,慢是糖尿病性微血管并发症之一,是导致终末期肾衰竭的主要原因,严重影响了患者的生活质量和危害患者的生命健康。的发病机制非常复杂,尚未完全清楚,目前认为是多种复杂的因素,如糖代谢异常、肾脏血流动力学、蛋白质酶糖基化、氧化应激、多元醇通路激活、遗传易感基因等综合作用的结果。近年来,醛糖复原酶在糖尿病慢性并发症包括的发生所起的作用日益受到关注。醛糖复原酶是多元醇通路中重要的限速酶,持续高血糖刺激下,醛糖复原酶被激活,通过活化多元醇通路,启动了一系列过程如高渗应激,葡萄糖及脂质的氧化应激,蛋白的非酶糖基化等单独或协同作用损伤肾脏微血管内皮细胞、肾小球和肾小管细胞,引起细胞外基质增加,系膜扩张,肾脏肥大,从而导致糖尿病肾病的发生。是高糖致糖尿病肾病发病

2、的重要的信号传递分子,信号通路是细胞信号传递的交汇点或共同通路。目前研究认为,细胞内高糖刺激下,多元醇通路激活后可以通过二酯酰甘油通路、氧化应激、蛋白质非酶糖基化等环节最终导致通路的激活,进而磷酸化转录因子,调节与细胞生长、增殖、分化和细胞外基质蛋白相关基因的表达,促进或加重糖尿病慢性并发症的病变过程。黄连素,【,又称小檗碱是从小檗属植物黄连,、黄柏 根茎中提取出的一种异喹啉类生物碱。既往大量研究证实:黄连素具有降血糖、降血脂、降血压,抑制醛糖复原酶、抗氧化等药理活性,这些研究显示了黄连素作为防治糖尿病并发症用药具有一定中山大学硕十学位论文黄连素调节醉糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究的临床价值和应用前景。近年来有研究发现:黄连素可以明显改善型塘尿病大鼠的肾脏损害,保护肾功能,延缓糖尿病肾脏病变的发生和开展。信号通路研究黄连素抗糖尿病目前,尚未见到从影响醛糖复原酶/肾病的作用机制的研究报道。因此,在前人研究根底上,本课题通过体内、体外实验观察黄连素对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用,对高糖培养的大鼠肾小信号转导通路球系膜细胞细胞增殖与胶原合成的影响,从醛糖复原酶/方面探讨黄连素抗糖尿

3、病肾病可能的作用机制。第一章黄连素对糖尿病肾损伤大鼠肾功能保护作用及醛糖复原酶的影响体内实验研究目的、观察黄连素对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用、观察黄连素对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾损伤大鼠氧化应激、肾脏醛糖复原酶活性及其和蛋白表达的影响研究方法、模型复制、分组、给药:只大鼠,体重为士,禁食小时后,单次腹腔注射/链脲佐菌素,以枸椽酸钠溶液稀释,.,冰盒中新鲜配制复制糖尿病大鼠模型。注射后测血糖,以禁食血糖./者,为糖尿病模型大鼠。选取糖尿病模型大鼠只,随机分为模型组、黄连素组,每组各只。选同批次只正常大鼠做为正常对照组。糖尿墒模型复制成功后次日,黄连素组大鼠给予.%醋酸纤维素钠溶液制成的黄连索混悬液,灌胃,剂量为./。模型组和正常对照组给予等体积的.%醋酸纤维素钠溶液。每同给药时间,每周给药天,共观察周。实验期间大鼠自由进食、饮水,不使用胰岛素等降糖药物。中山大学硕士学位论文黄连素调节酵糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究、肾功能相关指标检测:血糖用葡萄糖氧化酶法检钡;血尿素氮、血肌酐分别用酶法、速率法由全自动生化分析仪进行检测;尿蛋白测定用磺基水杨酸?硫酸钠比浊法;

4、常规方法制备石蜡切片,作染色,应用.高清晰度彩色病理图像分析系统.测定肾小球平均面积、平均体积。、抗氧化指标检测:按照试剂盒说明,用嘌呤氧化酶法检测血清超氧化物歧化酶活性:用硫代巴比妥酸法检测血清脂质过氧化物代谢产物一丙二醛含量。、肾组织醛糖复原酶活性、和蛋白表达的检测分别应用紫外分光光度法、 方法。研究结果、黄连素对诱导的糖尿病肾损伤大鼠肾功能相关指标的影响实验周时,糖尿病模型组与正常对照组相比,体重明显下降,肾重/体重肥大指数、血糖、均明显升高.,肾小球面积和肾小球体积明显增大,提示糖尿病大鼠肾脏肥大、肾小球受损、肾功能障碍形成,糖尿病肾损伤动物模型建立成功。模型组相比拟,黄连素能有效控制体重下降,明显改善肾脏肥大指数,显著降低血糖、尸.,明显减小肾小球面积和肾小球体积.,提示黄连素能明显改善诱导的糖尿病大鼠肾功能的损伤。、黄连素对诱导的糖尿病肾损伤大鼠血清活力和含量的影响与正常组相比,模型组大鼠血清超氧化物歧化酶的活性明显下降尸.,而脂质过氧化物代谢产物丙二醛含量显著增加?.,提示了糖尿病早期肾功能受损时伴有机体氧化应激的增强。黄连素组与模型组相比拟,血清活性明显增加.,含量显著

5、下降尸.,提示黄连素能增加机体抗氧化能力。、黄连素对诱导的糖尿病肾损伤大鼠肾脏醛塘复原酶活性及其和蛋白表达的影响中山大学硕十学位论文黄连素调节醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究糖尿病模型组与正常对照组相比,肾组织活性明显增加尸.,肾组织 及其蛋白表达均明显增加尸.,提示了糖尿病早期肾功能受损时伴有多元醇通路的激活。与模型组相比,黄连素能够明显降低肾组织活性.,明显下调肾组织表达水平和蛋白表达.,提示黄连素能降低醛糖复原酶活性从而抑制多元醇通路的激活。结论、黄连素对诱导的糖尿病肾损伤大鼠的肾功能具有明显的保护作用。、黄连素对糖尿病肾损伤大鼠的保护作用可能与提高机体抗氧化能力、抑制肾脏醛糖复原酶的激活有关。第二章黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞醛糖复原酶/信号通路的影响体外实验研究目的、观察黄连素对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖,胶原合成等方面的影响、观察黄连素对高糖培养的肾小球系膜细胞醛糖复原酶/信号通路的影响,探讨黄连素抗糖尿病肾病可能的作用机制。研究方法、实验分组:正常组.,甘露醇组.高糖组,:醛塘复原酶抑制剂十:抑带齐中山大学硕士学位论文黄连素调节醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病

6、肾病的研究、比色法和.掺入法检测高糖培养系膜细胞增殖情况。、.掺入法检测高糖培养系膜细胞胶原合成情况。、抗氧化指标检测:流式细胞仪检测高糖培养系膜细胞超氧阴离子生成;按照试剂盒说明,用嘌呤氧化酶法检测高糖培养系膜细胞超氧化物歧化酶活性;用硫代巴比妥酸法检测高糖培养系膜细胞脂质过氧化物代谢产物一丙二醛含量。、高糖培养系膜细胞醛糖复原酶活性、和蛋白表达的检测分别应用紫外分光光度法、 方法。、检测高糖培养系膜细胞总、磷酸化、磷酸化和纤维连接蛋白蛋白表达改变。研究结果、黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响实验结果显示,与正常对照组相比拟,高糖组、依帕司他阳性药对照组和黄连素低、中剂量组活细胞数明显增加庐.。与高糖组相比,依帕司他组和黄连素低、中剂量组活细胞数有下降的趋势,但无显著性差异.。阳性药对照组和黄连素高剂量组的活细胞数与高糖组相比那么明显减少庐.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异矿.。掺入实验结果显示,与正常对照组相比拟,高糖组、依帕司他阳性药对照组和黄连素低、中剂量组的掺入量明显增加.。阳性药对照组和黄连素高剂量组的.掺入量与高糖组相比拟明显减少,.。甘露醇组与正常组相比无

7、显著性差异.。该结果与上述实验结果相一致。、黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞胶原合成的影响.掺入实验结果显示,与正常对照组相比拟,高糖组的.掺入量明显增加.。与高糖组相比拟,依帕司他阳性药对照组、阳性药对照组和黄连素各剂量组的.掺入量均明显减少.。黄连素各剂量组与依帕司他组、组相比拟.掺入量均无显著性差异中山大学硕十学位论文黄连素调节醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究矿.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异.。、黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞醛糖复原酶的影响醛塘复原酶活性的改变高糖组醛糖复原酶活性较正常对照组明显增.。依帕司他阳性药对照组和黄连素各剂量组醛糖复原酶活性与高糖组相比明显降低.。黄连素高剂量组醛糖复原酶活性与依帕司他阳性药对照组相比明显降低矿.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异矿.。醛糖复原酶表达水平的改变高糖组醛糖复原酶表达水平较正常对照组明显升高.。依帕司他阳性药对照组和黄连素各剂量组醛糖复原酶表达水平与高糖组相比明显下降.。黄连素各剂量组醛糖复原酶表达水平与依帕司他阳性药对照组相比明显降低庐.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异.。醛塘复原酶蛋白表达水平的改

8、变高糖组醛糖复原酶蛋白表达水平较正常对照组明显升高.。依帕司他阳性药对照组和黄连素各剂量组醛糖复原酶蛋白表达与高糖组相比明显下降.。黄连素各剂量组醛糖复原酶蛋白表达与依帕司他组无显著性差异矿.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异矿.。、黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响超氧阴离子生成情况的改变与正常对照组相比拟,高糖组和黄连素低、中剂量组的超氧阴离子的生成明显增;.。与高糖组相比拟,依帕司他阳性药对照组和黄连素高剂量组的超氧阴离子的生成明显减少.。黄连素高剂量组超氧阴离子含量与依帕司他组相比无显著性差异.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异矿.。中山大学硕七学位论文黄连素调节醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究活力的改变与正常对照组相比拟,高糖组和黄连素低剂量组的活力明显降低.。与高糖组相比拟,依帕司他阳性药对照组和黄连素高剂量组的活力明显升高.,黄连素低、中剂量组的活力虽有升高的趋势,但无统计学差异沪.。黄连素高剂量组活力与依帕司他阳性药对照组相比无显著性差异.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异.。含量的改变与正常对照组相比拟,高糖组和黄连素低、中剂量组的含量明显增加.

9、。依帕司他阳性药对照组和黄连素高剂量组含量与高糖组相比明显降低.。黄连素高剂量组含量与依帕司他阳性药对照组相比无显著性差异.。甘露醇组与正常组相比无显著性差异矿.。、黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞蛋白的影响对结果进行灰度分析。高糖组和黄连素各剂量组总的表达水平较正常对照组明显升高驴.,提示高糖刺激引起系膜细胞总蛋白表达的上调。与高糖组相比拟,依帕司他阳性药对照组和阳性药对照组的总的表达下调眵.。黄连素各剂量组总的表达与高糖组相比无显著性差异矿.,提示黄连素对高糖引起的系膜细胞总蛋白表达上调无明显影响。甘露醇组与正常组相比无显著性差异矿.。高糖组磷酸化的表达水平与正常对照组相比明显升高.。与高糖组相比,依帕司他阳性药对照组、阳性药对照组和黄连素各剂量组的的磷酸化表达明显减少.。黄连素高剂量组磷酸化表达减少最为显著,与两个阳性药对照组相比有显著性差异.,提示黄连素能降低高糖引起磷酸化水平。甘露醇组与正常组相比无显著性差异.。、黄连素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞磷酸化的影响对磷酸化的结果进行灰度分析。高糖组的磷酸化中山大学硕十学位论文黄连素调节醛糖复原酶/信号通路抗糖尿病肾病的研究的表达与正常对照组相比明显增加.。与高糖组相比拟,依帕司他阳性

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