引物设计原则(必看)
7页1、mi引物设计原则1. 引物的长度一般为1530 bp,常用的是1827 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加.3。 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败.5端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。4。 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm4(G+C)2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。6. G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反
2、映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低(绝对值不超过9),而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4。5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8。 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的,Tm之间的差异最好控制在1度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构. 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰. 引物3端不可修饰. 引物3端要避开密码
3、子的第3位。1。引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70或有连续8个互补碱基同源. 2。避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(G)小于58。6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为1530bp,一般为2027mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因为38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74),不能保证产物的特异性。 4。G+C含量 G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值510。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为5580,其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基
4、的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6。引物自身 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp. 7。引物之间 两引物之间不应不互补性,尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3端 引物的延伸是从3端开始的,不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(ASPCR)反应中,引物3端不能发生错配. 在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP(四种dNTP各200mol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95,25s;55,25s;72,1min的循环参数扩增HIV1 gag基因区的条件下,引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20,AG和CC错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。 9
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