基因工程重点考点归纳

1、第一章1. 简述基因工程中的四大要素。答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。2. 简述基因工程诞生的基础。答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。1971年，史密斯(Smith H. O.)等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分 子，标志着DNA重组时代的开始。1972年伯格(Berg P.)等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来，得到新的DNA分子。1973年，科恩(Cohen S.)等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组 质粒转入E.coli细胞中。理论上的三大发现：(1) DNA是遗传物质(2) DNA 双螺旋模型(Watson/Crick 1953)(3) 确定了遗传信息传递的方式(60年代)技术上的三大发明：(1)工具酶的使用【Smith和Wilcox(1970)流感嗜血杆菌分离纯 化了 Hind II其它工具酶(如连接酶)等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】(2) 基因运载工具DNA载体的使用(对质粒的认识)【细菌的致 育因子一F因子Lederberg 1946抗药性因子(R

2、) 大肠杆菌素因(Col)】(3) 逆转录酶的使用【Baltimomore和Temin (1970)各自发现了 逆转录酶】意义：丰富了 “中心法则”真核基因的制备成为可能、构建cDNA文库成为可能。第二早1简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制一修饰系统R-M Restriction-modification system)0 R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。根据酶的亚单位组 成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。2.II型限制性内切酶的特点答:II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。 识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3 -羟基和5-磷酸基团 的DNA产物，需Mg2+,相应的修饰酶只需SAM。其识别序列主要为4-6bp，或更长且 呈二重对称的特殊序列。3举例：你使用过的工具酶，用于做什么？应该注意的问题T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶的分子量为68 kDa，催化DNA5磷酸基与3 羟基 之间形成磷酸二酯键。应注意的问题是连接反应条件需

3、要ATP,若在16C反应，大约需4小时；若在4C反 应，则需反应过夜。第三章1. 简述蓝白斑筛选的原理。如果插入的目标基因较小，仅使用蓝白斑筛选合适吗？对于白 色菌落还需要做哪些进一步的鉴定？答：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体a -互补的遗传特征筛选重组子。宿 主大肠杆菌的DNA的短区段，lacZAM15基因：缺失p -半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸 的lacZ基因，无酶学活性。而载体一般带有lacZz : N-端140个氨基酸的lacZ基因， 其产物无酶学活性。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）,它并不破坏读框，但 可使少数几个氨基酸插入到P -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码 p -半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性， 但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段 的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为a -互补。由a -互补而 产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而 易于识别。然而，

4、当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，由于插入片段较大，几乎不可 避免地导致无a -互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重 组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。对于较小的基因片段，由于其可能无法完全阻止a -互补，通常会出现假阴性。如要进一步确认，可对白斑提取质粒，再对质粒进行双酶切，电泳以确定，所取白斑的 菌中含有目的基因。2作为克隆载体应具备哪些条件？比较pBR322, pUC19和pUC119相同和不同点？ 答：克隆载体应具备的条件：（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗生基因（3）具若干限制酶 单一识别位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。pBR322 与 pUC19 相比：共同点：pUC19和pUC119从pBR322改造得来的，它们含有相同的ori和氨苄青霉素 抗性基因；pUC119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来。不同点：（1） pUC19抗性基因的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核 酸内切限制酶的单识别位点，（2） pUC19含有大肠杆菌p -半乳糖酶基因（lacZ）的启动子 及其编码a -肽链的DNA序列，此结构特称为l

5、acZ，基因（3） pUC19含有位于lacZ，基因 中的靠近5，-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能（4）pUC19 的分子量比pBR322小的多，只有2686bp （5） pBR322还含有四环素抗性基因。pUC19与pUC119相比，pUC119多了 M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进 入噬菌体颗粒所必须的顺式序列（IG）。3.为什么在辅助噬菌体M13K07帮助下可以有效地制备ssDNA?答：M13K07的突变基因II产物优先与克隆于噬菌粒pUCll8和pUCll9中的病毒复制起点的 作用，这就使噬菌粒正链DNA能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌 粒的单链DNA能够占据优势。第四章&第五章1. 对比下列各组概念：（1）克隆载体、表达载体和穿梭载体(2) plasmid, phagemid and cosmid(3) PAC, BAC and YAC答：(1)克隆载体:以扩增或保存DNA片段为目的的载体，一般具有复制起点，抗菌素抗生 基因，若干限制酶单一识别位点和较小的分子量和较高的拷贝数。表达载体是在常规克隆载 体的基础上衍生而

6、来，主要增添了增强子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件， 进行DNA重组的目的是要获得表达产物。相对于克隆载体来说增加了表达元件，基本骨架 是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，表达形式主要是融合蛋白的 形式，表达载体除了提供复制属性外，主要是形成一种表达所必须的环境。穿梭载体能够在 两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，主要为质粒载体，相对与克隆载体和表达载体而 言，穿梭载体至少含有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。穿梭载体一 般在大肠杆菌中保藏、扩增，然后将其转到目标宿主中。(2) plasmid:质粒，指的是染色体外能进行自我复制的双链闭合环状DNA分子，通常一个 质粒含有一个Ori以及与此相关的顺式作用元件，复制方式分为严谨型和松弛型且具有不相 容性和转移性。phagemid是噬菌粒，指的是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质 粒和丝状噬菌体的特征于一身的载体，具有ColEl复制起点及抗生素抗性选择标记，以及 丝状体噬菌体的间隔区，由于基因II蛋白存在有利于产生ssDNA，带有这种质粒的细菌被 M13丝状噬菌体感染后，在基因II蛋白

7、影响下质粒复制方式发生改变。Cosmid是黏粒，指 的是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒，组成包括质粒的复制起点、抗性基因、cos位 点，可以像质粒一样转化和增殖。(3) YAC(酵母人工染色体载体)：结构上能够模拟真正酵母染色体的线状DNA分子，其 工作状态是线状的，YAC载体以环状的形式存在，增加了大肠杆菌质粒载体的复制元件和 选择标记，以便保存和增殖。其中复制元件是其核心组成成分，有ARS、TEL、CEN,选择 标记主要是采用营养缺陷型基因。BAC (细菌人工染色体载体)：其与常规克隆载体的核心 区别在于其复制单元的特殊性，BAC复制单元来自F质粒，其载体的低拷贝数可以避免嵌 合体的产生，减少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用，其标记基因是氯霉素抗性基 因PAC(P1人工染色体载体)：PAC载体结合了 P1载体和BAC载体的最佳特性，相当于 P1噬菌体的改进载体。2. 简述用YAC为载体时，重组菌的筛选方法。答：YAC载体的选择标记主要是采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺 陷基因trp1、leu2和his3,尿嘧啶合成缺陷型基因ura3，以及赭石突变抑制基

8、因sup4。其宿 主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。赭石突变酵母菌在基本培养基上形 成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的 突变效应，形成正常的白色菌落。第一步筛选：营养互补筛选，第二步筛选：看颜色改变是 否表现出插入抑制基因致其失活。3. 简述pET表达系统，如何控制外源基因的表达？答：有两套系统可控制外源基因的严谨表达，一套是通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实 现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE, 它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从 而减少在未诱导情况下外源基因的表达。另一套是使启动子的控制效应更严谨，在pET载 体上装载acl基因，提高阻抑物的浓度。同时也可利用T7-lac启动子(在T7启动子序列下 游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列)，当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因 和外源基因表达的双重阻遏。4

9、. 为什么采用增加融合标签的技术，表达外源基因？答：因为当蛋白表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目的蛋白的关键因素。通过融 合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质，可对目的蛋白进行分离和纯 化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽S转移酶、 六聚组氨酸肽、蛋白质A和纤维素结合域等，其主要是因为这样可以分离纯化目的蛋白。第五次1.比较各组概念：（1）琼脂糖电泳、PAGE、PFGE（2）southern blotting、northern blotting、western blotting（3）RT-PCR DD-RT-PCR Real time PCR答：（1）琼脂糖电泳：用于DNA的分离、检测和纯化。检测DNA是否真的存在、是否有 降解现象，以及DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何。对0.8-10kb的DNA分离 效果最佳。PAGE :即聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测小分子核酸的大小（如小相对分子量RNA、寡核 苷酸、DNA序列分析等），或在同位素标记的情况下分析单链核酸（如分离寡核苷酸探针和 DNA测序等）。对100 bp-1kb的核酸分离效果最佳。PFGE:即脉冲场凝胶电泳。分离大相对分子质量的DNA的片段。原理是用一种交替 变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上 按“Z”字形向前泳动，从而达到分离大相对分子质量的DNA片段的目的。针对50kb或 100kb以上，甚至Mb级的大片段DNA。（2）southern blotting:即将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜上，然后进行分子杂交，在 滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。该技术主要用来判断某一生物样品中是否 存在某一基因，以及该基因所在的限制酶切片段的大小。前提是必须有探针。northern blotting:与Southern杂交相似，只是在Blotting过程中转移的是RNA。主要用 来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从

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