细胞凋亡实验步骤及注意事项
3页1、细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死 细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡 普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定 生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己结束生命的自 主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆 浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进 一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引 起炎症反应。在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为 180-200bp 或它的整倍数的 各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder (梯状带纹)的特征。相
2、比之下,坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎 症反应,坏死过程中细胞核 DNA 虽也降解,但由于存在各种长度不等的 DNA 片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋 亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏 感程度。三尖杉酯碱(HT )是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血 病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.025pg/ml范围内作用2小时, 即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1pg/ml HT在 体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide PI)对细胞进行双重染色,可以 区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏 死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死 细胞
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