核酶ribozyme.ppt

第十章主要讲授内容l一、概述l二、剪接型核酶l三、剪切型核酶l四、核酶的应用l五、核酶技术面临的问题l六、脱氧核酶（deoxyribozyme)1、人们对酶及生物催化剂的认识一、概一、概 述述生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶 extremozyme 抗体酶 abzyme 生物工程酶其它： 模拟酶核酸类:克隆酶修饰酶新酶RibozymeDeoxyribozyme酶的化学本质 1）．大多数酶是蛋白质（Most enzymes are proteins） 1926年美国Sumner 脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质 J.B.SumnerJ.H.Northrop2）．某些RNA有催化活性 1982年美国T. Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发 现RNA有催化活性 Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E. coli tRNA的前体加工。

Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催 化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶 ），2人共同获1989年诺贝尔化学奖 1．Cell vol 31, 147～157，1982年 2．Sci. Amer. Vol 255, 64～75，1986 3）．抗体酶（abzyme） 抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体 分子的可变区 （即肽链的N端）是识别抗原的 活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性 1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体 4）．有些DNA也有催化活性 1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性 l3、核酶作用的特点l 化学本质: RNAl 底物：RNAl 反应特异性(专一性）：碱基l 催化效率： 低l 产物剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶 丁型肝炎病毒核酶 RNaseP4.核酶的分类二、剪接型核酶l定义：剪接型核酶的作用机制是通过既 剪又接的方式除去内含子（Intron)，具有 核酸内切酶和连接酶的活性。

l分类：–I类内含子–II类内含子1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing)l剪接机制lL-19IVS在体外的多种酶活性l核酶是一种金属依赖酶l结构与功能的关系–引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列l 5‘CUCUCU3’l 3’GGGAGG5’切断磷酸二酯键的位置一条RNA链中两碱基之间的磷酸二酯键每个磷酸二酯键含有两个“非搭桥”氧原子（Rp和Sp ）与两个连接氧原子，同Sp氧结合的Mg2+可在剪接反应 中起重要作用pHO-GppP-GOHpP-G3‘HOⅠ类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子内含子5‘3’核酶是一种金属依赖酶l金属离子的作用：l1、中和RNA链上的负电荷，增加“刚性”；l2、利用金属离子的鳌合作用发挥空间诱导效应，使核酶和底物形成复杂的空间结构；l3、产生H+，诱导并参与体系的电子或质子传递，催化体系发生催化反应C C C U C UOP+HOG3’OAoo oC C C U C UOPOAoO GC C C U C UOH+P-oGoAoo过渡态C C C U C UOPOAoO GoC C C U C UOPOAoO GMg 2+Mg 2+o过渡态金属离子催化1、转核苷酸作用2CpCpCpCpC → CpCpCpCpCpC + CpCpCpC 2、水解作用CpCpCpCpC → CpCpCpC + pC 3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU → CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用CpCpCpCpCp → CpCpCpCpC +Pi 5、限制性内切酶作用―CpUpCpUpN― + G → CpUpCpU + ―GpN L-19IVS在体外的多种酶活性L19 RNA催化机理Ⅰ类内含子二级结构通式保守序列G结合位点剪接部位引导序列2、Ⅱ类内含子的自我剪接l剪接机制l结构与功能的关系p2‘HO-App-Ap3’OHp P-AHO 3’Ⅱ类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成5‘ 3‘外显子连接mRNA剪接过程mRNA剪接反应是 在剪接体（ splicesome)上进行的.5种snRNA 剪接体50多蛋白质Ⅱ类内含子有一个保 守的二级结构：结构域Ⅰ：两个保守 内含子结构序列 EBS1,EBS2与两个外 显子结构序列 IBS1,IBS2互相配对 。

结构域Ⅴ：高度保守 ，催化活性必需结构域Ⅵ：A 提供2’- OH Ⅱ类内含子二级结构模式5 ’ 3’三、剪切型核酶l1、自身催化剪切型RNAl 1.1 剪切机制l 1.2 结构与功能的关系l 锤头结构 (Hammerhead)l 发夹结构(Hairpin)l 斧头结构(Axehead)l 假结样结构(Pseudoknot-like)l 1.3 影响核酶活性的因素l2、异体催化剪切型RNAl定义：核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶 ，能剪切所有tRNA前体的5’端，除去多余的序 列，形成3’-OH 和 5’-磷酸末端l组成：RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成l体外： M1RNA具催化作用蛋白质作为辅助因子l体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必 需的特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点 ，自我剪切，产生5’-OH 和2’,3’-环磷酸二酯末端不同tRNA的 5’ 端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在 RNaseP的组分内没有引导序列， RNaseP所识别的是底物的高级结构。

RNaseP底物的二级结构剪切位点M1 RNA 5’端完整结构对维持催化活 性是必需的五、核酶技术面临的问题1、提高催化效率2、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入 靶细胞3、使核酶在细胞内有调控地高效表达4、增强核酶在细胞内的稳定性5、对宿主的损伤问题有待进一步考察l1994年，Breaker等，体外选择技术，发现了切割RNA的DNA分子－－脱氧核酶l功能：切割RNA、DNA水解酶功能、连接酶功能、多核苷酸激酶、过氧化物酶功能、催化卟啉环金属鳌合物形成lDNA适体（aptamer）：能与有机合物或蛋白质等配体专一、高效结合的DNA片段 六、脱氧核酶的研究1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子•通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有 自我裂解功能的活性分子来实现的•通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的 脱氧核酶被筛选出来：8-17，10-23BAA5‘BBAB APCRPCR5‘5‘5‘ Streptavidin Column NaOHcofactor体外选择技术 筛选具有自我裂解功能的DNA分子DNA分子库10-23型脱氧核酶作用机理RY RRNA substrate切割点R=A or GY=C or Udeoxyribozyme532、脱氧核酶催化特征•双链稳定性越高，酶活性越高• 结合臂的长度影响酶催化转换性：RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。

• 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性• 组氨酸，精氨酸促进催化活性• 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降 低切割活性）l与核酶相比，脱氧核酶的特点：–在生理pH下，更稳定–相对分子质量较小，结构相对简单，受空间结构影响较小–剪切RNA的识别靶位点不同UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCUAA AGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH 3’ G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘ rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜虫rRNA前体自我剪接反应锤头（Hammerhead)结构l二级结构模型l锤头结构的类型l锤头核酶的催化反应机制• 三个双螺旋区 • 13个核苷酸残基保守序列 • 剪切反应在右上方GUX序列的3’端自动发生a. 二级结构 b.空间立体结构示意图锤头型核酶锤头结构的五种类型R示酶，S示底物，箭头示剪切位点锤头型核酶对切割位点的识别位 点遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）催化过程需要二价金属离子参与单金属离子催化双金属离子催化 发夹（hairpin ）结构l发现于三种不同植物RNA病毒：烟草环 点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥 花叶病毒。

l三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星 RNA的负链，分别是sTRSV, sCYMVT, sARMV, 均为单链RNAl 发夹核酶结构模型l 发夹核酶金属离子在催化反应中起结 构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高 •剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端5‘3‘发夹二级结构模型剪切位点HDV RNA斧头结构模式 •三个碱基对的茎•需要二价阳离子，•产生5‘-OH和2’,3’-环磷酸剪切部位剪切部位G U A C G G C C G G UG C C G G C U G G G GC A U UC C G A G G G G A CCAAG U A A U G G C U C C C C U GcC G GG U C C A G C C U UC CG CC UC A G G UA A G C G3‘5‘剪切 位点HDV 核酶假结样结构ⅠⅡⅢⅣL3L4J1/2J1/4J2/4四个螺旋区，三个连接区，两个环活性中心区： J1/4, J2/4, L3剪切位点：688/689影响核酶活性的因素l1、pH值：最适pH为7.0-7.5l2、二价金属阳离子：Mg 2+、Mn 2+ l3、抗生素：大多数为抑制效应l4、变性剂l5、温度：在65℃范围内随温度升高而增加 ，37 ℃时均有适宜的活性。

四、核酶的应用一、在医学领域中应用的特点：2. 免疫源性低，很少引起免疫反应3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可 作为转基因表达产物，也可以直接以人工合 成的寡核苷酸形式在体内转运1. 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达 ，抑制效率高，专一性强核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝 炎病毒（ HCV）以及丁型肝炎病毒（HDV）作用的研究2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)核酶1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶 抑制HIV-Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期3、抗肿瘤治疗核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的 mRNA, 抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的二、在其他领域的应用防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块 茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷 叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆 等。