中护微生物-实验4免疫学试验.ppt

实验四 免疫学试验,一、吞噬细胞的吞噬作用（示教）,实验内容 中性粒细胞的吞噬作用（体内法）,巨噬细胞的吞噬作用（体外法）,非特异性免疫： 是机体在种系进化过程中逐渐建立起来的一系列天然防御功能,是经遗传获得，能传给下一代包括：,屏障结构：皮肤黏膜屏障、血脑屏障、胎盘屏障,吞噬细胞：小吞噬细胞——中性粒细胞、嗜酸性粒细胞 大吞噬细胞——单核吞噬细胞系统,正常体液中的抗微生物物质：补体、溶菌酶、乙型溶素,（一）中性粒细胞的吞噬作用：,实验前1小时小鼠腹腔内注射1ml无菌肉汤,,小鼠腹腔内注射白色葡萄球菌1ml， 让小鼠活动45min,,颈椎脱臼法处死小鼠，吸取腹腔液涂片,,自然干燥，瑞特氏染色后，油镜观察,镜下可见： 中性粒细胞的细胞核染成深紫红色，细胞浆染成淡粉红色，白色葡萄球菌染成深紫色如图,,,（二）巨噬细胞的吞噬作用：,前三天给小鼠腹腔内注射淀粉肉汤1ml,,实验当天给小鼠腹腔内注射Hanks液3-4ml后小鼠活动10min,眼球放血后颈椎脱臼处死小鼠,,,,,吸取腹腔液滴于载玻片上， 并滴加等量的 1%SRBC悬液,玻片置于湿盒内后37℃水浴箱 35-40min,,取出玻片在盐水中漂洗3次，自然干燥,,瑞特氏染色，油镜观察,镜下可见：,巨噬细胞核大，呈椭圆形、肾形或马蹄形。

核染色质比较疏松，染成淡紫色，胞浆染成浅灰蓝色发生吞噬时可见在巨噬细胞胞浆中有一个以上的有核鸡红细胞如吞噬的鸡红细胞多时则巨噬细胞核被挤到一侧，形态不规则如图所示,,瑞氏染色法：,于玻片上滴加瑞氏染液1-2滴染色1min 滴加4-5滴蒸馏水于玻片上，混匀染色液，染5~10min 流水冲洗，待干后用油镜观察,二、抗原-抗体反应,,（一）凝 集 反 应,实验原理 颗粒性抗原（细菌、细胞等）与相应的抗体在体外结合，在一定的条件下，形成肉眼可见凝集小块的反应，称为凝集反应参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素实 验 方 法,直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体直接结合，所出现的凝集现象，包括试管凝集反应、玻片凝集反应 间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）吸附在与免疫无关的载体颗粒表面，使此颗粒致敏（或称免疫球），然后再与相应抗体（或抗原）混合，在适当条件下，发生凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应1.玻片凝集反应,原理：已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上，在有电解质存在的条件下，若两者相对应，则会发生凝集，在澄清的液体中出现明显的凝集块 主要用途：抗原的定性分析，如菌种鉴定、分型及血型的鉴定。

玻片凝集反应—ABO血型鉴定的方法,取加有抗A血清与抗B血清载玻片1张 红细胞悬液的制备 取试管一支分装生理盐水0.5ml 消毒耳垂或手指尖皮肤 用采血针采1—2滴血，加入盛有生理盐水的小 试管中混匀（待测的抗原） 用毛细吸管吸取待测的抗原各一滴于抗A、抗B血清内，分别用牙签研磨均匀 置室温于5分钟左右观察结果,结果判断,,抗原抗体结合出现肉眼可见颗粒，其周围液体澄清为阳性反应；仍是均匀浑浊乳状液者为阴性反应稀释待检血清（对倍法） 加已知抗原 混匀；520C水浴，2—4h 观察结果,2.试管凝集反应,,,,实验材料,1.抗体：1:10 稀释的伤寒杆菌“ H ”免疫血清 2.菌液 ：伤寒杆菌“ H ”菌液 3.生理盐水、 5ml 吸管、 1ml 吸管、小试管、小试管架、水浴箱等试管凝集反应的方法 （1）于试管架上列一排试管， 每排8支 （2）每管内加入生理盐水0.5ml （3）对倍稀释：第一管加入1:10伤寒诊断血清0.5ml，混匀后取0.5ml，加入第二管内，依此类推，直到第7管再从第7管中吸出0.5ml弃去第8管为对照管 （4）每管加入H菌液0.5ml （5）混匀，置 370C 孵育18－24h，观察结果。

0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,,0.5ml,,试管凝集反应的方法,结 果 观 察,试管凝集 各管出现不同程度的凝集现象： ＋＋＋＋ 液体澄清，细菌全部凝集，沉于管底形成 大片凝集物 ＋＋＋ 液体基本澄清，细菌大部分凝集，管底的 凝集物稍小 ＋＋ 液体半澄清，稍显浑浊，但仍可见明显 凝集块 － 液体浑浊，无凝集块，轻摇试管，有细菌 呈线状浮起结 果 观 察,效价：抗原抗体反应时，发生明显反应的最高血清稀释度，又称滴度 凝集效价：凝集反应时，出现“++”凝集现象的最高血清稀释度血清的凝集效价,思考题,根据试管凝集反应的结果，一份免疫血清的效价是 1:320 ，另一份是 1:1280 ，哪一份免疫血清中抗体的含量高？,（二）沉淀反应,实验原理 可溶性抗原（细菌培养滤液、血清蛋白、组织浸出液等）与特异性抗体在体外结合，在一定条件下，出现肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应参与反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素1.环状沉淀反应 2.单向琼脂扩散 3.双向琼脂扩散,,实 验 方 法,1.环状沉淀反应,方法： （1）加入已知抗血清 （2）加待测抗原于抗血清层上面 （3）置室温15分钟 结果：阳性-白色沉淀环 定性试验,步 骤：,取3支沉淀小管 每管加入适量抗人血清 分别加入人血清、牛血清、N.S 静置3—5分钟，观察结果,,,,2.单向琼脂扩散,抗原在含抗体的生理盐水琼脂介质中扩散的一种方法。

结果：孔周围形成白色沉淀环,（1）基本原理,在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml) 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平2）实验材料,2%离子琼脂或生理盐水琼脂（采用0.9%的生理盐水, 内含0.1% NaN3） 标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产） 工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产） PBS （pH7.2，0.01M）. 打孔器（孔径3mm）及打孔模板 微量加样器 湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料） 已制备好的含有1%马抗人IgG抗体的琼脂板 稀释的单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50）,（3）实验方法,标准曲线的制备：示教 1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4ml，在分装2%盐水琼脂时即为2ml溶化后置56°C-60°C水浴中平衡温度备用。

2．稀释抗体，用pH7.2的PBS稀释标准抗人IgG抗体，终浓度为抗体效价的一倍例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70稀释并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等 3．制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG抗体于56°C水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56°C-60°C的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧翻转试管1-2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可 4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm 5．稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80及1/160 6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul注意：每一稀释度均应更换塑料吸头） 7．将加样的琼脂板放湿盒中，置37°C温箱，24小时后观察结果 8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。

人血清中IgG正常值的测定,1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm） 2．将单位正常人血清用PBS分别作1/50稀释 3．用微量加样器分别取1/50稀释的单人份血清标本10µl加入孔中，每份标本应各加两孔 2．作好标记放湿盒中，置37°C温箱，24小时后观察结果4）实验结果,测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的量（U/ml，），并换算为mg/ml5）注意事项,1．在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板 2. 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头3.双向琼脂扩散,Ag、Ab分别加于小孔内 Ag、Ab均在琼脂凝胶中扩散 合适之处形成白色沉淀线,双向琼脂扩散的原理,Ag、Ab分别加于小孔内， Ag、 Ab均在琼脂凝胶中扩散，合适之处形成白色沉淀线实验步骤：,制板 打孔 中间孔加兔抗人血清，周围加人血清、牛血清、生理盐水各2孔 置湿盒内，370C温箱24h，观察结果,,,,,,,,,,,,,5mm,3mm,三、免疫标记技术,将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（如酶、荧光素、放射性同位素、胶体金等等），通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应，从而测出微量的抗原或抗体。

酶联免疫吸附试验（ELISA）,原理：酶标抗体（或抗原）与抗原（或抗体）特异结合后，加酶的底物，由于酶的催化作用使底物发生水解、氧化后还原反应而显示颜色，可根据颜色差别来判断有无特异性抗原（或抗体）及量的多少 检测方法：有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法 间接法——用于测定抗体 双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原 抗原竞争法——主要用于测定小分子抗原,ELISA的原理图,1.乙肝病毒表面抗原（HBsAg）检测 ——ELISA双抗体夹心法,实验材料 酶标板（聚苯乙烯微量板） 抗-HBs（购自北京中山公司） 酶标记的抗-HBs 待检血清 包被缓冲液 封闭液 反应终止液,ELISA双抗体夹心法大致步骤：,,包被抗-HBs,加入待检标本,加入酶标抗-HBs,洗板,加酶底物,加终止液,,,,,,2.乙型肝炎病毒表面抗体检测 ——间接ELISA法,【测定原理】 采用纯化HBsAg包被反应板，加入待检标本，当标本中存在抗- HBs时，该抗体与包被HBsAg结合，再加入酶标羊抗人IgG抗体最后形成HBsAg-抗HBs-酶标抗抗体复合物，加入底物产生显色反应ELISA间接法大致步骤：,,包被HBsAg,加入待检标本,加入酶标羊抗人IgG抗体,洗板,加底物,加终止液,,,,,,【测定步骤】,1.每孔加入待测标本50ul，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔。

2.每孔加入酶结合物1滴（空白对照除外），置37℃孵育30分钟 3.手工洗板重复五次 4.每孔加入显色剂A液、B液各1滴，置37℃孵育15分钟 5.每孔加入终止液1滴，混匀 6.1)目测法：与阳性和阴性对照比较， 观察颜色深浅作出判断 2）用酶标仪读取各孔OD值四、过敏反应,过敏反应或变态反应的研究： 因为豚鼠易于过敏，最适合进行这方面研究如给豚鼠注射马血清很容易复制成过敏性休克动物模型 常用实验动物接受致敏物质的反应程度不同，其顺序为：豚鼠；；家兔；；狗；；小鼠；；猫；；蛙实验原理】,动物实验性过敏反应属于Ⅰ型超敏反应此型超敏反应发生快，具有严格的特异性及明显的个体差异反应过程中肥大细胞、嗜碱性粒细胞释放多种活性介质，引起特有症状本实验主要观察豚鼠的过敏反应现象 先给豚鼠注射小量异种蛋白，经过一定的潜伏期，动物处于致敏状态当第二次用较大剂量相同抗原注射豚鼠时，抗原激发豚鼠体内的肥大细胞或嗜碱性粒细胞，致使这些细胞释放多种生物活性介质，豚鼠迅速产生严重的过敏反应及至过敏性休克或死亡主要试剂与器材】,1.动物 体重200g左右的健康豚鼠2只 2.血清或鸡蛋清 3.菌注射器、针头、酒精棉球等。

操作方法】,1.豚鼠2只，经腹腔或皮下注射10%马血清(用生理盐水稀释)0.1ml(注：无马血清时、可用鸡蛋清作为抗原致敏) 2.2～3周后，心脏内注射(或选择豚鼠的耳缘静脉注射0.3～0.5ml)，一只注射马血清原液，另一只注射鸡蛋清，各2ml 3.射后数分钟内密切观察反应现象。