具有降血糖活性的茶多糖组分分离纯化与结构鉴定.pdf

江南大学博士学位论文具有降血糖活性的茶多糖组分分离纯化与结构鉴定姓名：王黎明申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：夏文水20060301中文摘要具有降血糖功能的茶多糖组分的分离纯化和结构研究中文摘要国内外已有大量报道证实茶多糖具有显著的降血糖功能，但有关其降血糖方式和结构的报道还不多资料显示水溶性茶多糖具有显著的降血糖功能，因此为了得到具有较高生理活性的茶多糖，本论文采用水提法提取茶多糖，然后从茶多糖对自由基的清除作用、对相关糖代谢酶活性的影响以及对葡萄糖往3 ”．L l 细胞转运的促进作用三个方面，体外研究茶多糖的降血糖方式，以此为依据，依次采用离子交换法和凝胶柱层析法从茶多糖中分离具有降血糖活性的组分，并对其一级结构进行深入研究和探讨为提高茶多糖含量测定的精确度，在茶多糖提取以前，首先对传统葸酮．硫酸法测定茶多糖的条件作了改进结果显示，测定茶多糖含量应以半乳糖为标准单糖，6 7 5 啪比色确定了茶多糖的测定条件以后，在不破坏茶多糖生理活性的温度范围内优化了茶多糖的提取工艺，得出水提法提取茶多糖的最佳工艺条件为：浸提时间9 0m i n ，浸提温度7 0 ℃，料水比lg ：1 0 m L 。

浸提3 次所得提取率为3 2 0 ％，高于资料报道的2 ．9 7 ％的最高提取率所提茶多糖经一系列纯化处理，纯度达到了8 9 ％接着从对羟基自由基和超氧自由基的清除作用、对小肠a - 葡萄糖苷酶和肝脏糖代谢酶活性的影响、以及对葡萄糖往3 ”．L 1 细胞转运的促进作用三个方面，体外研究茶多糖的降血糖方式结果发现茶多糖对羟基自由基和超氧自由基没有明显的清除作用，对葡萄糖往3 T 3 ．L l 细胞转运也没有明显的促进作用，对小肠洳葡糖苷酶活性的抑制作用也较低，但可显著增强肝脏葡萄糖激酶和己糖激酶活性浓度为1m g ／m I 胸茶多糖可使葡萄糖激酶和己糖激酶相对活性分别提高8 2 ．9 7 ％和9 9 ．5 7 ％；1 0m 咖L 的茶多糖可使它们分别提高1 5 2 ．0 9 ％和1 5 6 ．1 0 ％采用D D 垣．s e p h a r 0 ∞c L 6 B 离子交换色谱柱分离具有增强肝脏葡萄糖激酶和己糖激酶活性的多糖组分，共分出5 个组分：F A 、F B 、F C 、F D 、F E ，其中F A 和F c 均能显著增强己糖激酶和葡萄糖激酶活性茶多糖浓度为1m g ^ n L 时，F A 对己糖激酶和葡萄糖激酶相对活性的提高率分别为1 0 2 ．9 2 ％和6 0 ．3 l ％；F c 对己糖激酶和葡萄糖激酶相对活性的提高率分别为1 2 1 ．1 7 ％和1 3 7 ．8 1 ％。

进一步用s e p h a d c xG 7 5 分离F A 和F c ，得F A - l 、F A - 2 、F C - 1 和F C ．2 F A ．1 和F C - 1 可显著提高己糖激酶和葡萄糖激酶的相对活性，提高率分别为1 0 6 ．4 2 ％和7 2 ．9 2 ％以及1 4 2 ．2 2 ％和1 4 0 ．3 4 ％( 茶多糖浓度为lm g ，m L ) F A - 2 仅能显著增加己糖激酶的活性口 温水( 4 0 巧0 ℃) > 热水( 1 0 0 ℃) ；对于红茶，热水> 温水> 冰水；对于番茶，冰水> 热水> 温水，因此对不同种类的茶叶，要采用不同的浸提温度，在保持最佳生理活性的前提下，尽量提高提取率茶多糖的提取方法主要有综合提取法和单独提取法，近年来，酶、超声波、微波等常用于辅助茶多糖的提取1 ．1 ．2 综合提取法茶叶中除多糖以外，还含有茶多酚，咖啡碱、茶色素、氨基酸、芳香物质等多种有效成份综合提取和利用这些有效成份，可节省成本，变废为宝，不仅提高了经济效益，还减少了环境污染，但各种综合提取法主要集中在茶多糖、茶多酚和咖啡碱的综合提取上，具体有以下几种方法【1 秘】： ⋯一一，，茶渣一一1 ) 茶叶一粉碎一脱脂一加水浸提一离心．{ L 提取液一真空浓缩一浓缩液一醇沉淀一 ，沉淀一脱蛋白一茶多糖 离心_ {r 上清液一加N a C l L 上清液一回收乙醇一N a H c 0 3 调p H 5 ．3 ~ 5 ．7 ，A P 沉淀一离心．{ 。

沉淀一酸转溶一 厂酯萃取酯层加收一干燥一粗咖啡碱一升华一精制咖啡碱 1 L 离心一乙酸乙酯萃取一酯层回收一冷冻干燥一茶多酚广有机层一l 旦| 收氯仿一十燥一咖啡碱， 2 ) 原料一浸提一离心一上清液氯仿萃取_ 1广有机层一回收‘水层一乙酸乙酯萃取_ {：， L 水层一乙醇醇 ，．乙酸乙酯一干燥一茶多酚÷t ——一_{一——一一o乙析一离心一千燥一茶多糖；，滤渣一酸性乙醇提一滤液加丙酮一离心一茶多糖i ； 3 ) 原料一乙醇浸提一过滤{广有机层一干燥一咖啡碱j L 滤液一氯仿萃取1广有机层一：L 水层一乙酸乙酯萃取．{4 ‘L 水层一2第一章绪论广回收、精制、干燥一茶多酚L - 浓缩一千燥一水溶性复合物另外，陈荣义等闲采用大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂从茶叶的浸提液中分离了茶多糖、咖啡因、茶多酚和茶氨酸陈海霞【1 9 】也研究了茶多糖、茶多酚和咖啡碱的树脂综合提取法，发现聚酰胺、D 3 0 1 ．R ，D 3 贴以及2 号树脂对茶多酚的吸附率均在8 7 ％以上，动态吸附性能比静态吸附性能好，吸附后，聚酰胺和2 号树脂对三种物质的解吸率均在9 0 ％以上，而D 1 5 H 树脂对茶多酚的解吸率在9 8 ％以上，但对其吸附率却最低。

邓国栋等田l 采用温水浸提法提取粗多糖，过离子交换树脂分离得到咖啡因，过大孔吸附树脂分离得到茶叶黄酮，再采用鞍酸除蛋白，乙醇沉淀得茶多糖，茶多糖纯度达6 0 ％以上，相对相对分子质量在2 ~ 4 万之间，由5 种单糖组成的蛋白复合多糖1 ．1 ．3 单一提取法如在其它有效成份不考虑的情况下或所用原料为茶叶深加工企业的下脚料，茶多糖的提取可采用单一提取法，单一提取法主要有以下三种情况：1 ) 茶叶一粉碎一脱脂一过滤一滤渣一水浸提一过滤一滤液浓缩一乙醇沉淀一真空冷冻干燥一粗茶多糖( I ) 一脱蛋白、脱色一干燥一茶多糖( I I )2 ) 茶叶一粉碎一水浸提一过滤一滤液浓缩一乙醇沉淀一丙酮洗涤一真空冷冻干燥一粗茶多糖( I ) 一脱蛋白、脱色一干燥一茶多糖3 ) 原料一水浸提一超滤一取滤液一乙醇沉淀一干燥一茶多糖比较用单一提取法和综合提取法提取茶多糖的得率，结果发现单一提取法较综合提取法略高；单一提取( 3 ) 法所得茶多糖的纯度> 单一提取( 1 ) 法> 单一提取( 2 ) 法：综合提取( 1 ) 法提取所得的多糖纯度> 综合提取( 3 ) 法> 综合提取( 2 ) 法最近，刘冬等【2 7 】报道了一种茶多糖提取新工艺：4 ) 原料一称重一匀浆一酶解一溶剂提取一过滤一超滤浓缩一乙醇沉淀一s e v a g 法除蛋白一多糖产品。

具体方法为：茶叶原料一加5 倍质量的水，匀浆一O ．2 0 ％的纤维素酶在4 0 ℃，p H5 ．O 条件下水解4h 一加3 0 倍原料质量的水在8 0 ℃，p H6 ．5 条件下浸提3h 一过滤一滤液经M 、) I r C 0 1 0 0 0 0 0 超滤膜在4 5 ~ 5 0 ℃，O ．4 0M P a 下浓缩至原体积的l ／3 —6 5 ％终浓度乙醇沉淀一S e v a g 法脱蛋白一6 0 ℃真空干燥一茶多糖制品1 ．1 4 酶法提取酶工程技术近几年广泛用于辅助天然植物有效成份的提取【昝3 2 】．植物细胞壁是由纤维索、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构【3 3 硼在药用植物有效成分提取过程中，当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力选用适当的酶作用于药用植物材料，如水解纤维素的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等等，一方面可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果扛南大学博士学位论文胶质等物质降解，破坏细胞壁的致密结构，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而有利于有效成分的溶出另一方面，通过选择适当的酶类，可以有效地使中药材中的目标物溶出，同时控制非目标物的溶出，在提高溶出效率的同时，为后续步骤提取液的精制创造有利条件。

谭淑宜【3 7 】等发现，在茶汤中添加O ．3 ％的纤维素酶可使多糖浸出率提高2 0 ％左右傅博强等【3 3 】比较了低温水法提取茶多糖和酶法提取茶多糖，发现酶法提取的多糖含量比水法提取的高6 3 ．3 ％，多糖总提取率达2 ．9 7 ％，粗多糖( 干重) 总提取率达7 ．9 3 ％，而且采用酶法提取的茶多糖具有较强的抑制a ．淀粉酶活性的能力酶法提取茶多糖过程中，影响多糖提取率的各因素主次关系为：水解时间> 酶用量>固液比；最佳工艺条件为水解时间1 2 0m i I I ，酶用量2 ．2 ¨u g ，固液比1 ：1 4 酶法提取茶多糖的优点是作用条件温和，通过酶法破壁去除杂质可以明显提高得率但该技术同时存在着一定的局限性：1 ) 酶的最适温度及最适p H 值往往在一个很小的范围内，为使酶的活性提高到最大值，必须严格控制酶反应温度和p H ，反应条件的微小波动都可能使酶的活性大大降低，因此对实验设备的要求较高2 ) 酶法提取过程中，酶有可能会与多糖产生反应，使多糖降解因此酶法提取茶多糖尚需进一步深入研究1 ．1 ．5 超声波法近年来，超声波也常被用于辅助多糖的提取【3 9 】傅博强等阱】在研究了纤维素酶法提取茶多糖最佳工艺的基础上，还研究了超声振荡对多糖提取率的影响，并与相同条件下无酶水提法进行了比较，结果表明采用超声波辅助酶法时，超声波一酶提法的多糖提取率比酶解一超声法低1 0 ．4 ％，比单独酶解法低6 ．1 ％。

这可能是由于加入酶后超声会使一部分酶变性失活，从而降低提取率；而酶解一超声法是先酶提后超声波辅助，则可避免此问题，超声振荡还可进一步破坏已被酶解的细胞壁，使通过细胞多孔透析膜的可溶性物质增加，多糖提取率增高，比单独酶解法高4 ．1 ％1 ．1 ．6 微波法周志【博】以中、低档绿茶为原料，研究了微波提取茶多糖技术，结果表明微波水提结合醇析法制备茶多糖的得率为2 ．5 2 ％，经S e v a g 法脱蛋白后，其多糖得率和含糖量依次为1 ．5 6 ％和3 0 ．3 ％，紫外和红外光谱证实微波对茶多糖的化学结构无影响1 ．2 茶多糖分离纯化1 ．2 ．t 脱蛋白粗多糖中含大量蛋白等杂质常用的脱蛋白方法有S c 、，a g 法【4 ‘H ”、三氟三氯乙烷法【4 2 】、三氯乙酸法【4 3 删等前两种多用于微生物多糖，后一种多用于植物多糖，其中S e v a g法是经典的脱蛋白方法，其优点是操作条件温和，可避免多糖降解，缺点是一次只能脱去少量蛋白，而且即使重复多次，也难将蛋白除尽倪德江等【1 卅报道，s e v a g 法脱蛋白4第一章绪论的效果主要在前三次，不同茶类，蛋白质的去除率不同：研究比较发现，前三次共脱去绿茶多糖中总蛋白的4 0 ％，而只脱去乌龙茶多糖中总蛋白的2 1 ％。

李布青等【1 7 】认为茶多糖为酸性多糖，其酸性基团可与杂质蛋白上的碱性氨基酸产生静电结合，这给茶多糖脱蛋白工作增加了困难汪东风等【1 6 】认为茶多糖是一类与蛋白相结合的糖复合物，即茶多糖的糖链上可能存在结合蛋白，不能用蛋白酶去除茶多糖中的杂蛋白，然而s e v a g 法又难将茶多糖中的游离杂蛋白除尽，因此在样品纯度要求高、原料来源广泛的情况下，可适当采用脱蛋白效果更好的三氯乙酸法虽然三氯乙酸法往往会引起某些多糖的降解，使得率降低【4 5 】，但张翼伸等嗍用酸水解等方法适当降解和改变云芝多糖的一级结构，发现并不影响云芝多糖的生理活性也可用三氟三氯乙烷法，该方法效率高，但三氟三氯乙烷易挥发，所以不宜大量应用1 ．2 ．2 脱色茶叶粗多糖的颜色较深，应根据所含色素的理化性质采取相应的脱色方法常用的脱色方法有离子交换法【1 7 1 、氧化。