培养基制备和灵敏度检查及无菌检查用培养基方法.doc

培养基制备及灵敏度检查法和无菌检查用培养基培养基应适合需气菌、厌气菌或真菌的生长，可使用符合规定的脱水 培养基，均以121C灭菌30分钟1. 需气菌、厌气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）脱水培养基：硫乙醇酸盐流体培养基配方：硫乙醇酸盐流体培养基粉31.0g纯化水 1000ml配制：根据需要量称取硫乙醇酸盐流体培养基粉置适宜容器中，按配方比例加入纯化水，水 浴加热使溶解，调pH至7.10.2,分装于适宜容器，迸高压灭菌器灭菌121Cxl5分 钟真菌培养基脱水培养基：改良马丁培养基配方：改良马丁培养基粉 28.0g纯化水 1000ml配制：根据需要量称取改良马丁培养基粉，按配方比例加入纯化水，水浴加热使溶解，调pH至 6.40.2,分装于适宜容器，置高压灭菌器灭菌115Cx20分钟真菌琼脂培养基配方：改良马丁琼脂培养基粉 42.0g纯化水 1000ml根据需要量称取改良马丁琼脂培养基粉，按配方比例加入纯化水，水浴加热使溶解,调pH至6.4+0.2,分装于适宜容器，置高压灭菌器灭菌115Cx20分钟选择性培养基(1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)照上述需气 菌、厌气菌培养基及真菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0. 125g, 溶解后，摇匀，分装，灭菌。

2) 聚山梨酯80培养基(用于油剂约品的无菌检查)照上述需气菌、 厌气菌培养基及真菌培养基的处方及制法，各加10ml聚山梨酯80,摇匀， 分装，灭菌营养肉汤培养基脱水培养基：营养肉汤培养基配方:营养肉汤培养基 20g纯化水 1000ml配制：称取营养肉汤培养基2()克，加1000ml纯化水，加热溶解，加热至沸，冷却至常温，分装 于适宜容器，置高压灭菌器灭菌12PCX15分钟营养琼脂培养基 脱水培养基：营养琼脂培养基配方：营养琼脂培养基 20g纯化水 1000ml配制: 称取营养琼脂培养基2()克，加1000ml纯化水，加热溶解，加热至沸，冷却至常温,分装于适宜容器，置高压灭菌器灭菌12KCX15分钟培养基质量应通过灵敏度检査菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，试验用菌种应采用适宜的菌种保 藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC (B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ CMCC (B) 10104] 枯草芽砲杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501] 生孑包梭菌(Clostridium sporogenes) [ CMCC ( B )64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [ CMCC ( F) 98001]黑曲霉(Aspergillusn niger) [ CMCC (F) 98003 ]菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽陀杆菌的新鲜 培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生陀梭菌的新鲜培 养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30〜35 C培养18〜24小时；接种白色 念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20〜 25 C培养24〜48小时，上述培养物用0.9%氛化钠溶液制成每1ml含菌 数小于100CFU (菌落形成单位)的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改 良马丁琼脂培养基上，23〜28 C培养5〜7天，加入3〜5ml无菌的含0・05 % (ml/ml)聚山梨酯80的0.9 %氯化钠溶液，将陀子洗脱然后，用适宜 的方法吸出砲子悬液至无菌试管内，用无菌的含0. 05 % (ml/ml)聚山梨酯 80的0.9 %氯化钠溶液制成每lml含孑包子数小于100CFU的砲子悬液菌 悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存于2〜8 C可在24小时内 使用黑曲霉砲子悬液可保存在2〜8 C ,在验证过的贮存期内使用培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流休培养基9支，分别 接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽砲杆菌、生砲 梭菌各2支，另1支不接种，作为空白对照，置30〜35 C培养3天； 取每管装量为9而的改良马丁培养基5支,分别接种小于100CFU的白色 念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种，作为空白对照，置20〜25 C培 养5天逐H观察结果结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养 基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定对照用菌液1•金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液取金黄色葡萄球 菌［CMCC(B)26003］的营养琼脂斜而新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤 培养基内，在30〜35C培养16〜18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 每lml中含10〜100个菌。

2. 生葩梭菌(Clostridium sporogenes)菌液 取生砲梭菌 ［CMCC(B) 64941］的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同 培养基内，在30〜35C培养18〜24小时，用0. 9%无菌氯化钠溶液稀释至 每lml中含10〜100个菌3. 白色念珠菌(Candida albicans)菌液 取白色念珠菌［CMCC (F) 98001］ 的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20〜 25C培养24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每lml中含10〜100个 菌抑细菌和抑真菌试验在用直接接种法无菌检查丽，可用如卜•方法测定供试品是否貝有抑细 菌和抑真菌作用用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别 接种金黄色葡萄球菌、生抱梭菌、白色念珠菌均10〜100个菌各两管，其 中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定的温度，培养3〜5天如培 养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生 长微弱、缓慢或不生长，均判为供试品有抑菌作用该供试品需用稀释法 （种入较大量培养基中）或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌 性后，方可接种至培养基。

无菌检查法无菌检查法包扌4直接接种法和薄膜过滤法前者适用于非抗菌作用 的供试品，后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消 毒后，以无菌的方法取内容物凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照1.直接接种法（1）供试品准备供试品如为外科敷料，取供试品4个包装，以无菌操作拆开包装，于不 同部位分别剪取约lOOmg或1 cmX 3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最 小包装5个，拆开包装，共取11股，接种于足以浸没供试品的适量培养基 中供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个, 接种于足以浸没供试品的适量培养基中或用0.9%无菌氯化钠溶液各40ml, 分别冲洗内壁（输血、输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查 2.操作取上述备妥的供试品，以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌 培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液51,作阳性对照， 另接种于真菌培养基5管轻轻摇动，使供试品与培养基混合需气菌、厌 气菌培养基管置30〜35C、真菌培养基管置20〜25C培养14 Ro在培养 期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

阳性对照管在24小时内应有菌生长, 如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后，不能从外观上判断有无 微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基小或斜面培养基上 继续培养，细菌培养2 H,真菌培养3 R,观察是否再出现浑浊或斜面有 无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌2.薄膜过滤法如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下 规定的方法处理后，加入0. 9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少 100ml >|,混合后，通过装有孔径不大于0.45um的薄膜过滤器，然后用 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长 将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基分别加至薄 膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份，分别加入上述二种 培养基中，按规定温度和时间培养阳性对照管应根据供试品特性加入相 应对照菌液51（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物, 以生鞄梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）阳性对照管 细菌应在培养24〜48小时，真菌应在培养24〜72小时有菌生长结果判断当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据 观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显 浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真 菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取2倍量供试品, 分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为 供试品不合格。