生物化学实验PPT课件 8蔗糖酶Km值测定.ppt

实验八 蔗糖酶Km值测定 1. 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面 2. Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所 对应的底物浓度 3. 不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值 也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小 ：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大 4. 测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本 内容之一 底物浓度对酶活性的影响 原理 原理 米氏方程和双倒数作图法 酶反应速度与底物浓度之间的定量关系 S表示底物浓度 Vmax表示最大酶促反应速度 Lineeraver-Burk（林-贝氏作图法） 实验步骤 一、蔗糖酶溶解 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 三、底物对反应速度的影响（Km测定） 一、蔗糖酶的溶解 酶粉溶于1 ml蒸馏水，10000 rpm室温离心 5分钟后去掉不溶物，此时即为酶原液 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 1、将酶原液按照一定比例稀释，建议1:10，1:20， 1:50和1:100不同稀释倍数的酶液各准备2 ml 2、稀释后酶液的活力测定 为什么要将酶液进行稀释？ 为什么选择合适酶活力的酶液进行Km测定？ 3、葡萄糖标准曲线的制备。

酶活力预试 12（对对照） 0.3M蔗糖溶液ml0.600.60 H2O1.11.1 pH5.0醋酸缓缓冲液ml0.20.2 25水浴中保温3min 稀释释后的蔗糖酶溶液ml （1:20; 1:50; 1:100; 1:200; ） 0.10 25水浴5min 二硝基水杨杨酸试剂试剂22 稀释释后的蔗糖酶溶液ml （1:20; 1:50; 1:100; 1:200） 00.1 沸水浴煮5min 取出后经自来水冷却3 min，加入9 ml蒸馏水，以对照管调零点， 于520nm处测光密度值 要求测得的A520nm值在标准曲线范围内靠近最大值 为什么？ 葡萄糖标准曲线的制备 加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100）中准确煮5 min，取 出用自来水冷却3min，加入9 ml蒸馏水，混匀后以零号管调零， 于520nm处测定光密度 以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图 管号 试剂试剂 012345 1mg/ml标标准葡萄糖溶 液 ml 00.20.40.60.81.0 0.1mol/L醋酸缓缓冲液 pH5.0 ml 0.20.20.20.20.20.2 H2O ml1.81.61.41.21.00.8 二硝基水杨杨酸溶液ml222222 底物浓度与酶促反应速度 管号 试剂试剂 1 2 3 4 5 6 7 0.3 M蔗糖溶液ml0.040.060.080.100.200.400.60 H2O1.661.641.621.601.501.301.10 pH5.0醋酸缓缓冲液，ml0.20.20.20.20.20.20.2 25预热3分钟 加入0.1ml稀释释合适倍数的酶液 25准确反应应5 min，迅速加入2 ml二硝基水杨杨酸溶液 混匀，沸水浴5min，自来水冷却3min，加入9ml蒸馏馏水，以对对照管调调“0”，520nm测测OD值值。

每只试管均要做自身对照 结果处理 管号 结果 1234567 OD520 葡萄糖产量，mg v =葡萄糖产量10 1ml酶在单位时间 (5min)内的葡 萄糖产量 (mg) S=0.3V/2 (mol/L) 1/S 1/v v代表生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内1ml酶液反应生成的葡萄糖的量） ； S=0.3V/2 ： S代表底物蔗糖的摩尔浓度；V代表每只试管中加入的底物蔗糖的体 积（ml）；2指的是反应的总体积是2ml；0.3为底物蔗糖的浓度 思 考 题 Km值的含义及测定的方法。