【最新word论文】p19ARF和p16INK4a在人骨肉瘤中表达的比较研究【临床医学专业论文】.doc

1p19ARF 和 p16INK4a 在人骨肉瘤中表达的比较研究【摘要】 目的 比较 p16INK4a 和 p19ARF 两种抑癌基因在可切除的人骨肉瘤组织中的表达形式,探讨其在人骨肉瘤的发生、发展中的意义方法 人骨肉瘤切除石蜡标本 37 例,用单克隆抗体间接免疫荧光法同时测定肿瘤组织的 p16、p19蛋白的表达结果 p16INK4a 表达率 56.8％（21/37） ， p19ARF 表达率40.5％（15/37） ；p16 与 p19 表达无相关性；p16 和 p19 与骨肉瘤的外科分期、病理分级、血管浸润和肺部转移均无显著相关结论 p16、p19 的下调都很可能是骨肉瘤发生发展的重要原因之一，未发现这两种抑癌基因之间的表达有显著关系 【关键词】 人骨肉瘤 p16INK4a p19ARF 周期蛋白依赖激酶抑制剂0 引言p16IN K4a(以下简称 p16) 基因改变在人类恶性肿瘤中普遍存在[1,2], 包括人骨肉瘤[3]p16 基因所在的 IN K4a 位点还编码一种 p19ARF (以下简称 p19)基因,它是 p53 的上游基因,也是一种重要的抑癌基因[4]迄今尚未见有关 p19 在人骨肉瘤组织中表达情况的报道。

本文通过检测人类可切除性骨肉瘤组织中 p16和 p19 蛋白的表达形式,探讨这两种抑癌基因在骨肉瘤中的意义1 资料与方法1.1 对象与标本 骨肉瘤标本 37 例, 同济医院 2001 年 1 月～2004 年 6 月手术切除并石蜡包埋标本 37 例，男性 21 例，女性 16 例，年龄 12～57 岁标本经甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚度 5μm所有病例术前均未接受过放化疗1.2 实验方法与主要试剂 应用间接免疫荧光法检测组织中 p19 和 p16 的表达: 5μm 连续切片,脱腊至水;每个标本切两张，分别加入 25μl 的 p19 和 p16的一抗，完全覆盖住玻片上的组织，室温孵育 60min；用洗涤液洗 3 次，各5min加入标记 FITC 标记的抗体（二抗）25μl，室温孵育 20min用固定液封片观察前空气干燥 30min所用两种一抗分别为鼠抗人 p19 单克隆抗体(武汉晶美公司 ),工作浓度1∶100;鼠抗人 p16 单克隆抗体(武汉晶美公司),工作浓度 1∶100;二抗为 FITC标记酶羊抗鼠 IgG(武汉晶美公司)，工作浓度 1∶1001.3 结果判定 荧光显微镜下观察染色切片，胞浆或胞膜出现绿色颗粒为阳性细胞。

每张切片随机观察 5 个高倍视野按阳性细胞所占比例分为“-”：细胞未染色；“+”：阳性细胞<50%; “++”: 阳性细胞>50%1.4 统计学处理 采用 SPSS 10.0 软件分析, P＜0.05 为有显著差异22 结果2.1 p16 和 p19 在骨肉瘤中的表达 骨肉瘤中的 p16 表达率 56.8％（21/37） ；骨肉瘤中的 p19 表达率 40.5％（15/37） 在骨肉瘤中，p16 和 p19 的表达无明显相关性，同时表达 p16 和 p19 的有 5 例，见表 1表 1 骨肉瘤分型与 p16 和 p19 表达的关系（略）从表达形式看，p16 在骨肉瘤中有胞浆型 12 例和胞膜型 9 例p19 在骨肉瘤中的表达有胞膜型 8 例，胞浆型 3 例和核型 4 例2.2 p16 和 p19 的表达阳性者，年龄集中于 10～20 岁；男性阳性比例高于女性尤以 p16 较明显2.3 p16 和 p19 的表达与骨肉瘤病理学指标的关系，见表 2表 2 骨肉瘤病理学指标与 p16 和 p19 阳性率（略）注：37 例病史资料完整，32 例有肿瘤大小及分化的病理资料; * 高分化 vs 中、低分化3 讨论骨肉瘤是运动系统常见的恶性肿瘤，可发生于各种年龄，其中 75%发生于青少年，病情凶险，预后较差，多数病例在原发灶较小的早期即发生广泛的肺转移，越来越多的研究结果表明，骨肉瘤的恶性表型及预后与癌基因的过量表达和抑癌基因缺失密切相关[5]。

p16 基因编码的 p16 蛋白为细胞周期的一种负性调节因子，其缺失为肿瘤的侵润和转移提供了选择性的生长优势p16 蛋白可与细胞周期素 D 竞争结合细胞周期依赖性激酶（CDK4） ，使 CDK4 失活，从而阻止 Rb 的磷酸化，去磷酸化的 Rb以活性形式结合 E2F 及 ATF2 等转录因子，阻止细胞从 G1 期进入 S 期[6]p19是近年被注意到的一种潜在重要的抑癌基因，它与 p16 虽然位于同一个基因位点，有一个外显子相同，但阅读框架不同，因而抑癌机制不同，p16 通过 pRb 起作用，而 p19 则通过上游基因 p53 起作用有人发现人类 p19ARF 通过结合 MDM2 并加速其衰解，从而加强 p53 蛋白的稳定性，引起 p53 在体内的积聚[7,8]敲除 p19而保留 p16 表达的细胞，迅速产生各种肿瘤，提示在某些肿瘤 p19 才是真正的肿瘤抑制蛋白缺乏 p19 的小鼠早年就会发生肿瘤[9]已发现在人 T 细胞白血病、非小细胞和口腔磷癌有 p19 的下调，而在骨肉瘤尚无报道本实验用免疫荧光间接法同时检测在同一骨肉瘤组织中 p16 和 p19 这两种既相互联系，又完全不同的抑癌基因的表达。

我们发现在骨肉瘤中，两者的表达率都比较高（56.8％和 40.5％） ，但两者间无明显相关性，同时表达 p16 和 p19 的只有 5 例3我们的研究发现，p16 和 p19 的表达率与骨肉瘤的病理分期负相关，提示p16 及 p19 的异常可能与骨肉瘤的进展有关（见表 2） 两者虽然在有肺转移的病理切片中的表达率比较高，但由于例数不多，统计学上无显著意义综上所述，我们的研究证实 p16 及 p19 的下调和骨肉瘤的发生发展有密切联系，并且这两种抑癌基因之间的表达无显著相关目前认为肿瘤的发生机制是多基因多步骤的，1995 年 cyclin D1CDK4p16PRb Path way 理论[10]的提出揭开了多因素研究的序幕，今后骨肿瘤病因学研究也将沿此方向深入下去本实验还证实 p16INK4a 和 p19ARF 在骨肉瘤中表达途径不同，为进一步研究使用多基因联合治疗骨肉瘤提供了实验基础参考文献】［1］ Wong SC，Chan JK，Lee KC， et al. Differential expression of p16/ p21/ p27 and cyclin D1/ D3, and their relationships to cell proliferation, apoptosis, and tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast[J]. J Pathol, 2001, 194 (1):3542.［２］ Esteller M， Gonzalez S，Risques RA， et al. K ras and p16 aberrations confer poor prognosis in human colorectal cancer［J］. J Clin Oncol, 2001,19 (2):299304.［３］ 杨俊涛，孙运才．骨肉瘤中 p16 抑癌基因的表达及意义［J］ ． 中华骨科杂志，1998,5:288．［４］ Molofsky AV，He S，Bydon M， et al. Bmi1 promotes neural stem cell selfrenewal and neural development but not mouse growth and survival by repressing the p16Ink4a and p19Arf senescence pathways［J］.Genes Dev, 2005,19(12):14321437.［５］ Weinborg RA. Oncogene,antioncogene and the molecular basis of multistep carcinogenesis［J］. Cancer Res,1989，49(6):37133719．［６］ Liggett WH Jr, Sidransky D. Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer［J］. J Clin Oncol, 1998，16(3):11971206. 4［７］ Martoriati A，Doumont G，Alcalay M， et al. Dapk1, encoding an activator of a p19ARFp53mediated apoptotic checkpoint, is a transcription target of p53［J］. Oncogene， 2005, 24(8):14611466.［８］ Pomerantz J，SchreiberAgus N，Liegeois NJ， et al. The Ink4a tumor suppressor gene product, p19ARF, interacts with MDM2 and neutralizes MDM2's inhibition of p53［J］.Cell, 1998, 92(6):713723.［９］ Sarkar A，VergilisI，Sharpless NE， et al.Impaired processing of DNA photoproducts and ultraviolet hypermutability with loss of p16INK4a or p19ARF［J］. J Natl Cancer Inst, 2004, 96(23):17901793.［１０］L ukas J，A ugaurd L，Struass M. Oncogenic aberrations of p16/IN K4/ CDKN 2 and cyclin D1 cooperate to deregulate G1 control［J］. J Cancer Res, 1995, 55: 4818 4823.。