人参皂甙对应激大鼠肝脏热休克蛋白70表达的影响临床医学论文.doc

人参皂甙对应激大鼠肝脏热休克蛋白70表达的影响_临床医学论文 作者：李宁 金法 吴可人 徐涛 裘华森【摘要】 　　目的 研究人参皂甙对应激时肝脏热休克蛋白(HSP)70表达的影响，探讨其抗应激的作用机制 方法 54只SD大鼠分为三组:干预组和模型组各24只，分别以人参皂甙溶液或生理盐水灌胃；对照组6只，予正常饮食采用盲肠结扎穿孔法（cecum ligation and perforation，CLP）制作应激模型分别于造模后6、12、24及72h检测大鼠肝细胞HSP 70的表达及血清IL-6水平的变化结果 除12h外，干预组肝细胞HSP70的表达均＞对照组（P＜0.05）干预组72h肝细胞HSP70表达＞模型组（P＜0.05）干预组血清IL-6水平整体呈下降趋势，除6h外，各时点明显＜模型组（P＜0.05）结论 人参皂甙可提高应激时大鼠肝细胞HSP70的表达，并可抑制IL-6的产生，减轻炎症反应，保护应激时的机体 【关键词】 人参皂甙 应激 热休克蛋白70 白细胞介素6　　【Abstract】Objective To study the effect and mechanism of panaxoside on the expression of liver heat-shock protein-70 in condition of stress. Methods 54 SD rats were divided into panaxoside treating group（n=24）,which were fed with 0.5% panaxoside liquor at 50mg/kg via gastric tube , stress model group （n=24）and normal control group（n=6）. Cecum ligature and perforation (CLP) method were used to establish the model. The expression of HSP-70 and serum concentration of IL-6 were evaluated at 6h, 12h, 24h and 72h after operation. Results In panaxoside treating group, the expression of HSP-70 was higher(p<0.05) than normal group at every time point except 12h, and in stress model group it is higher(p<0.05) than in normal group at 72h after operation. IL-6 level were decreased after CLP in panaxoside group, and it was lower in panaxoside group than in stress model group 12h、72h after CLP (p<0.05). Conclusions Panaxoside can promote the expression of rat liver cell HSP-70 so as to protect body under stress and inhibit the production of IL-6 in some way and release the inflammatory reaction.　　【Key words】 Panaxoside Stress Heat-shock protein 70 Interleukin-6　　应激是机体本能性地对于各种有害刺激作出的非特异性适应反应。

严重感染、创伤、手术等应激可诱发机体产生一系列适应性反应 对机体而言，应激的最终结果取决于应激源的性质、强度和持续时间，若上述因素超出一定的范围，可使机体正常内稳态破坏、基础疾病发生 发展 ，甚至导致死亡强烈应激严重影响人类的身心健康，因此对抗应激药物的研究有重要意义作者2006年12月7日至25日，采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制作应激模型，通过检测大鼠肝细胞热休克蛋白(HSP)70的表达及血清IL-6水平的变化，观察人参皂甙对应激时肝脏HSP70表达及炎症反应的影响，探讨人参皂甙保护应激机体的可能机制　　1 材料与方法 　　1.1 动物　　选用健康SD大鼠54只，体重约250g，由浙江中医药大学实验动物中心提供　　1.2 主要试剂及仪器　　人参皂甙（浙江省中 医院 制剂室提供），实验前用生理盐水稀释为0.5%的溶液备用；Rat IL-6 ELISA Kit（博士德公司产品）；兔抗人、小鼠、大鼠HSP-70多克隆抗体（博士德公司产品）；二抗（美国Zymed公司产品）　　1.3 实验方法　　应激模型制备：大鼠模型制备前12h禁食不禁水，称重后用3%戊巴比妥腹腔注射（45mg/kg）麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部脱毛消毒后，取下腹正中切口进腹，暴露盲肠后轻提出，用4号线环行结扎盲肠游离端1/3处（长约1.5 cm），注意避免损伤回盲部系膜血管，保持肠道畅通，用16号针头在结扎端贯通穿刺2次，挤出少量粪便，将肠管回纳入腹腔，用1号线单层连续缝合腹膜和皮肤，关腹，术后立即于双侧腹股沟皮下各注射1ml生理盐水，以补充术中液体丢失。

动物分组及处理：将动物随机分为对照组（n=6）、模型组（n=24）及干预组（n=24）干预组大鼠自由饮食，并以50mg/kg的0.5%人参皂甙溶液灌胃，1次/d；模型组以等量生理盐水灌胃 ；对照组自由饮食喂养7d后模型组及干预组行CLP，术后继予灌胃，术后6、12、24、72h分批麻醉后处死，每个时间点6只（ 自然 死亡者抛弃），对照组在72h处死均下腔静脉采血1.5ml测定IL-6含量，并切取肝脏，将肝脏标本置于10%福尔马林中固定、保存血液标本分置于离心管中，分别标记，放入37℃水浴箱内水浴0.5h，红细胞等凝集沉积后，离心3000rpm、10min，吸取上清液，标记后置于-20℃冰箱内冷冻保存待测　　1.4 观测指标及检测方法　　血清IL-6测定：酶联免疫吸附（ELISA）法测定，试剂购自博士德公司，严格按照试剂盒说明操作免疫组化检测肝细胞HSP70的表达：Envision法免疫组化染色，光镜下观察HSP70的表达，结果用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统在低倍镜下 计算 阳性面积百分比 (%)，每张切片随机选取5个视野，求平均值　　1.5 统计学方法　　应用SPSS 13.0统计软件，实验数据以(x±s)表示，采用单因素方差分析处理，样本均数间两两比较用q检验（SNK法）。

取双侧P<0.05为差异有统计学意义　　2 结果 模型组大鼠于模型制备后6h死亡2只，72h死亡1只，抛弃，其余组大鼠无死亡　　2.1 肝脏HSP70的表达 　　对照组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，肝窦清晰，窦内上皮细胞、枯否细胞均未见明显变化，汇管区小叶间动静脉、小叶间胆管结构清晰，HSP70主要表达在汇管区周围的肝细胞浆，呈放射状，表达水平低，间质细胞不表达模型组大鼠肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝小叶结构紊乱，肝窦变窄，窦腔内有胆汁聚集，门脉区有较多炎症细胞浸润，偶见点状坏死，HSP70表达特点同对照组，但表达面积和强度呈不同程度的上升干预组表达面积及强度较模型组稍高造模后干预组除12h外，HSP70的表达均较对照组高（P＜0.05）；模型组于造模后24h之后才较对照组高（Ｐ＜0.05）干预组与模型组比较，造模后6、12及24h肝细胞的HSP70表达差异无统计学意义，但72h干预组的肝细胞HSP70表达明显较模型组高(P＜0.05)详见表1、图1表1 人参皂甙对CLP大鼠肝脏HSP70表达的影响（略）注：与模型组比较，*Ｐ＜0.05；与对照组比较△P＜0.05　　2.2 血清IL-6水平　　对干预组大鼠血清IL-6各时间点的水平进行两两比较，造模后6h明显较其它时点高(P＜0.05)，总体水平呈下降趋势；模型组大鼠IL-6水平总体呈上升趋势。

与模型组比较，干预组造模后12、72h的IL-6水平明显较低(P＜0.05)；干预组造模后6h IL-6水平高于对照组（P＜0.05），12h后差异无统计学意义(P＞0.05)详见表2、图2表2 人参皂甙对CLP大鼠IL-6水平的影响（略） 注：与模型组比较，P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05　 　3 讨论 　　应激是机体本能性地对于各种有害刺激作出的非特异性适应反应诸多临床和动物模型的研究表明，应激可影响肝脏生理功能应激过程中产生的多种应激激素、介质和细胞因子可通过多种途径导致肝细胞的损伤和功能变化，而肝细胞的损伤和功能改变，必将影响机体的应激调节功能，进而影响机体的预后或转归有研究证实去甲肾上腺素在肝脏产生IL-6有关键作用，予6-羟基多巴胺(6-OHDA, 一种化学性交感神经阻断剂)或手术切除肝交感神经能抑制应激导致的血浆IL-6升高［１］此外，Kitamura等［２］发现，制动应激可诱导肝脏IL-6 mRNA表达及血浆IL-6升高，并经免疫组化分析，IL-6主要在肝实质细胞表达阳性，而非间质细胞应激状态下，具有保护作用的蛋白质表达也明显增加，如急性期反应蛋白、热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)等。

HSP是一组高度保守的蛋白质，是细胞内一种内源性具有保护作用的物质，能够增强机体或细胞对打击的耐受，其中HSP70在正常细胞中表达水平较低，而在应激状态下可显著地高表达，具有重要的细胞保护作用［３，４］本研究结果显示，造模后各组大鼠肝细胞HSP70的表达先后升高，与 文献 相符［５，６］人参为扶正固本药，能主补五脏，安精神，大补元气，生津止渴，可挽救气脱危症及肺虚喘促、脾虚泄泻、消渴少津等一切虚症人参皂甙是人参中的主要有效药理成分, 能增加机体的抗应激能力［７］一般认为，人参皂甙能保护应激期垂体-肾上腺功能,使之免于衰竭,进而有利于垂体-肾上腺功能的恢复刘庆增［８］观察到人参提取液对内毒素引发的致热、白细胞骤降及休克死亡有较强的拮抗和防护效果，认为人参抗内毒素作用是适应原样中药，通过对机体反应的影响，改变机体应激状态，提高机体对各种有害刺激的防御能力本研究显示，造模后72h干预组大鼠的肝细胞HSP70表达明显较模型组高，表明人参皂甙能提高应激时大鼠肝细胞HSP70的表达；干预组血清IL-6水平整体呈下降趋势，盲肠结扎穿孔法(CLP)后12、72h明显低于模型组，说明人参皂甙能减轻CLP后大鼠的炎症反应，对应激大鼠有保护作用。

人参皂甙可提高应激时大鼠肝细胞HSP70的表达，抑制IL-6的产生，减轻炎症反应，保护应激时的机体，其确切机制尚待进一步探讨 参考 文献】 　　1 Nukina H, Sudo N, Aiba Y, et al. Restraint stress elevates the plasma interleukin-6 levels in germ-free mice. Neuroimmunol， 2001,115（1～2）:46.　　2 Kitamura H, Konno A, Morimatsu M,et al. Immobilization stress increases hepatic IL-6 expression in mice. Biochem Biophys Res Commun，1997,238（3）:707.　　3 赵祯,安冬艳,秦。