实验八 紫外吸收法检测dna的浓度与纯度.doc

实验八、紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度一、实验目的 学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度，从而测出DNA的浓度与纯度二、实验原理DNA的吸收峰在260nm，蛋白质的吸收峰在280nm1 μg/ml标准DNA样品A260=0.02，因此，A260=1时，双链DNA含量为50μg/ml；单链DNA与RNA含量为40μg/ml；寡聚核苷酸的含量为30μg/ml一般来说，纯净的DNA 其A260/A280的比值约为1.8，大于1.8表明样品中RNA污染严重，小于1.6说明有蛋白质或苯酚污染；纯净的RNA A260/A280的比值约为2.0，在样品中若含有蛋白质，会使A260/A280的比值下降三、实验材料紫外分光光度计、比色皿、移液枪、实验七中获得的质粒DNA四、实验步骤1、选取合适的按键待测定样品为dsDNA（如PCR产物），按下键“7/dsDNA”待测定样品为ssDNA（如反转录合成的第一链cDNA产物），按下键“8/ssDNA”待测定样品为RNA，按下键“9/RNA”待测定样品为Oligo（如PCR引物），按下键“6/Oligo”2、将空白对照置入样品孔注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。

例如，用Tris溶液溶解DNA样品，则要用Tris液做空白对照3、按下 “Blank”键仪器记录空白对照，设置为0.000A4、将样品置入样品孔，按下“Sample”键，仪器显示样品的吸光度和浓度值，以及其他相关参考比值五、实验结果与分析A260/A280=1.118，DNA浓度86.45A260/A280小于1.6，说明蛋白质或苯酚污染严重，这可能是在制备质粒DNA时加入的酚/氯仿不足，或加入酚/氯仿后没有混合均匀等原因DNA浓度偏低，可能是实验的多次弃上清过程中存在损耗六、思考题问：利用紫外-可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低？为什么？答：核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量，故结果偏高 。