侧链羟基氨基酸保护工艺优化研究.pdf

H027 侧链羟基氨基酸保护工艺优化研究 李鑫 朱颐申 应汉杰 （南京工业大学，制药与生命科学学院，210009，南京） 摘摘 要要 叔丁酯保护侧链羟基的 N-9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸是在多肽固相合成中应用广泛的保护氨基 酸，本文研究了侧链带有羟基的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的侧链保护合成工艺，着重对工艺进行了优化研 究，降低成本，提高反应收率 关键词关键词 氨基酸保护 侧链 羟基 工艺优化 OPTIMIZATION OF SYNTHETIC PROCEDURE OF PROTECTED SERINE, THREONINE AND TYROSINE LI Xin, ZHU Yishen, YING Hanjie (College of Life Science and Pharmacy, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, P. R. China) Abstract： Some N-Fmoc-Amino Acids, whose hydroxyl groups are protected by tert-butyl group, are widely used in solid phase peptide synthesis (SPPS). It was studied to protect hydroxyl group of serine, threonine and tyrosine with tert-butyl esters. It focused on optimization of their protected procedures in order to get higher yield and lower costing. Keywords amino acid protection, side chain, hydroxyl group, procedure optimization 引言 随着人类进入后基因时代，生命科学对蛋白质的研究越来越广泛和深入，多肽合成已经成 为本领域的研究热点之一。

氨基酸的保护是多肽合成中最基本、最重要的一环，尤其侧链带 有羟基氨基酸的保护有文献报道，α-羧基用苄酯或对硝基 phenyl 酯暂时性保护起来，用 叔丁基将羟基保护完成后利用氢解的方式将α-羧基的保护基脱除[1]还有关于在叔丁酯化 的过程中用甲酯的形式保护α-羧基，用苄氧羰基作为α-氨基的保护基的报道[2]，在接肽反 应中需要用氢解的方式脱除苄氧羰基用对酸敏感的叔丁基(tBu)保护 Fmoc-丝氨酸、Fmoc- 苏氨酸和 Fmoc-酪氨酸侧链羟基的合成工艺，采用较温和条件下以甲酯作为α-羧基的暂时 性封闭基团制备 Fmoc-氨基酸叔丁酯的方法[3]，相对于上两种方法，它具有简捷、快速的优 势，便于规模化生产众所周知，在固相多肽合成过程中是以过量保护氨基酸参与反应，而 侧链羟基的保护氨基酸市场售价极高， 由此增加多肽的合成成本， 因此对合成这类保护氨基 酸合成路线的优化就具有现实和长远意义 1． 试剂和仪器 1.1 试剂试剂 L－丝氨酸、L－苏氨酸、L－酪氨酸，中国医药集团上海化学试剂公司；9-芴甲氧羰基 琥珀酰亚胺，上海吉尔生化有限公司；异丁烯，南京 梅化化工厂；甲醇，上海陆都化学试剂厂；二氯甲烷(DCM)，上海凌峰化学试剂厂；其 它试剂均为南京化学试剂厂。

1.2 仪器 仪器 HH－2 数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；JJ－1 电动搅拌器，江苏金坛中大仪 器厂；SHB－III 循环水式多用真空泵，郑州长城料工有限公司；R－200 旋转蒸发器，瑞士 BUCHI 公司；磁力搅拌器，上海具曹行公社农机厂；XT4A 显微熔点测定仪，北京科仪电 光仪器厂；WZZ-2A 自动旋光仪，上海物理光学仪器厂 2. 实验方法 2.1 合成路线和方法合成路线和方法 HNCO2Me R OH HN CO2Me R O-t-Bu HN CO2H R O-t-Bu isobutylene TsOH/DCM a)NaCO3 or NaOH b)Fmoc-ONSu, NaCO3/dioxan R=CH3 Thr R=H Ser HClTsOH Fmoc 图 1 Fmoc- L-Ser（ tBu） 、Fmoc- L-Thr（tBu）合成路线 Fig.1 Synthesis procedure of Fmoc- L-Ser( tBu), Fmoc- L-Thr(tBu) HNCO2Medioxan 10%NaCO3 Fmoc-ONSu OH HNCO2Me OH isobutylene H2SO4/DCM HNCO2Me O-t-Bu NaCO3 H2O/CH3CN HNCO2H O-t-Bu HCl Fmoc Fmoc Fmoc 图 2 Fmoc-L-Tyr( tBu)合成路线 Fig.2 Synthesis procedure of Fmoc-L-Tyr( tBu) 2.2 异丁烯实验装置异丁烯实验装置 图中的标识表示： 1.异丁烯气瓶 2.甘油 3.缓冲瓶 4.CaCl2干燥塔 5.石油醚 6.乙醇 7. CaCl2干燥管 图 3 异丁烯反应装置 Fig 3 The isobutylene reaction setting 2.3 产品性质检测产品性质检测[4][5] 2.4 实验条件选择实验条件选择 本实验中分别探讨三种保护氨基酸合成工艺，优化工艺条件，研究了反应温度、反 应时间、气体通入量和 pH 等影响因素，以及酪氨酸中萃取试剂用量的影响。

3. 实验结果与讨论 3.1 丁烯的通入时间对保护反应的影响丁烯的通入时间对保护反应的影响 首先考察了异丁烯在 35Kpa 压力下的通入时间对保护反应的影响异丁烯是侧链 羟基的保护试剂， 它与侧链羟基反应生成叔丁酯的形式将侧链羟基保护起来 因此考察 异丁烯的通入时间是很重要的一个方面从图 4、图 5 可知 Ser、Thr 保护反应的通气最 佳时间为 48h，相比 72h[5]在工艺上有了改进，反应收率分别为 92%、77%Tyr 保护反 应的通气最佳时间为 6h，收率为 88% 20304050607080 40 50 60 70 80 90 100 Yield(%) t / h Ser Thr 34567 40 50 60 70 80 90 Yield(%) t / h 图 4 异丁烯通入量对 Ser、Thr 保护反应的影响 图 5 异丁烯通入量对 Tyr 保护反应的影响 Fig 4 Effects of isobutylene on Ser, Thr protected reaction Fig 5 Effects of isobutylene on Tyr protected reaction 102030405060 50 60 70 80 90 100 Yield(%) t / h Ser Thr 46810121416182022 40 50 60 70 80 90 100 Yield(%) t / h 图 6 时间对 Ser、Thr 的α-氨基保护反应影响 图 7 时间对 Tyrα-氨基保护反应的影响 Fig.6Effect of time on α-NH2 protection of Ser, Thr Fig.7 Effect of time on α-NH2 protection of Tyr 3.2 保护α-氨基的反应条件选择保护α-氨基的反应条件选择 从图 6、7 中，可以看出 Fmoc 基团的导入随时间的增加，收率升高。

对于 L-Ser、L-Thr， 当反应时间到达 36h 时，反应收率达到最大，分别为 97%和 95%；对于 L-Tyr，反应 12h 收率 达到最大为 96%随后，延长反应时间，收率反而下降，这是由于副反应作用升高，保护试 剂的错接，副产物增多，导致收率下降 图 8 为 pH 对 Fmoc-Ser 和 Fmoc-Thr 保护反应的影响， pH 值为 11 时， 反应收率达到最大， 分别为 95%和 93%温度对保护反应的影响见图 9，图中显示在温度为-5℃时，Fmoc-Ser 收 率达到最大为 97%；对于 Fmoc-Thr，温度为 0℃，反应收率最大为 95%；而 Fmoc-Tyr 在 3℃ 时达到最大收率为 89% 3.3 萃取剂对保护酪氨酸产品产率的影响萃取剂对保护酪氨酸产品产率的影响 在保护酪氨酸的工艺中，两步产品的获得都是靠萃取得到的，因此萃取剂的用量的优化，对 降低成本有很大的帮助，如图 10、图 11 所示在本工艺中最佳的萃取剂用量，MeOH/H2O 的 混合溶液用量为 0.6L，CHCl3的用量为 0.8L 4. 结论 L-丝氨酸优化保护反应条件：侧链羟基保护反应为在 35Kpa 压力下，与异丁烯气体反应 78910111213 0 20 40 60 80 100 Ser Thr Yield(%) pH -20-15-10-50510 40 50 60 70 80 90 100 Ser Thr Tyr Yield(%) T/℃T/℃ 图 8 pH 对 Ser、Thr α-氨基保护反应的影响 图 9 温度对 Ser、Thr 的α-氨基保护反应影响 Fig.8Effect of pH on α-NH2 protection of Ser, Thr Fig.9 Effect of temperature on α-NH2 protection of Ser, Thr 0.20.30.40.50.60.70.8 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Yield(%) V / L 0.40.60.81.01.2 55 60 65 70 75 80 85 Yield(%) V / L 图 10 MeOH/H2O 的用量对产品产率的影响 图 11 CHCl3萃取剂的用量对产品产率的影响 Fig.10 Effect of MeOH on protected reaction of Tyr Fig.11 Effect of CHCl3 on protected reaction of Tyr 表 1 主要性质比较 Table 1 Comparison of major physical properties with reference 48h；氨基保护反应在 pH 为 11，-5℃条件下搅拌反应 36h，产品总收率为 89.2%，纯度达到 98%以上。

L-苏氨酸优化保护反应条件：侧链羟基保护反应为在 35Kpa 压力下，与异丁烯气体反 应 48h；氨基保护反应在 pH 为 11，0℃条件下搅拌反应 36h，产品总收率为 73%，纯度达到 98%以上 L-酪氨酸优化保护反应条件：侧链保护反应在 35Kpa 压力下，与异丁烯气体反应 6h； 氨基保护反应在 pH 为 11，3℃条件下搅拌反应 12h，萃取剂 MeOH/H2O 的混合溶液最佳用 量为 0.6L，CHCl3的最佳用量为 0.8L，产品总收率为 79.6%，纯度达到 97.6%以上 L-丝氨酸、L-苏氨酸和 L-酪氨酸全保护产物的物化性质与文献值比较如表 1 所示， 参考文献参考文献 1 Victor J. Hruby；Kenneth W. Ehler. O-Benzyl-N-tert-butyloxycarbonyl-L-serine[J]. J. Org. Chem., 1970, 35(5), 1690-1690. 2 Francis M. Callahan; George W. Anderson; 。