大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定.doc

大豆根瘤菌的筛选及分子鉴定韩孝强（天津农学院 农学系）1 前言根瘤菌是可以与豆科植物共生形成根瘤，将空气中的氮还原成氨，提供植物营养并能促使植物异常增生的一类革兰氏阴性菌如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，称为类菌体[1]常制成细菌制剂即一种生物肥料在田间施用，作为作物或牧草增产的一种手段美国、澳大利亚、新西兰、日本、意大利、奥地利、加拿大、法国、荷兰、芬兰、泰国、韩国、印度及非洲的一些国家，至少有70多个国家研究、生产和应用豆科根瘤菌，不仅面积不断扩大，而且应用的豆科植物种类也日益繁多在美国、巴西等大豆种植的主要国家，根瘤菌接种率达到95%以上[2]世界各国一直在研究与豆科作物及其品种相匹配的优良根瘤菌生产用菌株，根瘤菌剂产品在稳步提高[3]我国微生物肥料的研究始于20世纪40年代，其研究与应用已有几十年的历史，在我国的农业生产中起了非常重要的作用最早研究应用的是根瘤菌制剂，代表和奠基人有张宪武先生、陈华癸院士和樊庆笙先生等[4]众所周知，大豆是富含蛋白质的一种作物，构成蛋白质的主要元素就是氮，而空气有80%都是由氮气组成的，根瘤菌正是利用了这种最廉价的原料来满足了大豆生长过程中氮元素的需要 [5]。

而且根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题[6]因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标[7]传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定[8]但近几十年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中己得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定[9]细菌含有3种不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA它们分别行使着不同的功能，其中rRNA可将遗传信息得以表达，转译成蛋白质，它在所有细菌中都有一定的碱基序列和空间结构不同种类的细菌，rRNA在不同位点上的序列改变频率也不同因此，这些分子可作为种系标记物用以鉴别不同的细菌原核生物的核糖体由50S和30S两个亚基组成，而30S亚基又包含3种类型的rRNA，即23S、16S和5S rRNA，它们分别含有约2900、1500和120个核苷酸。

5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析也较困难[10]16S rRNA为核糖体小亚基中的的RNA，而16S rDNA为编码该亚基RNA的基因从上世纪70年代以来，科学家们因16S rRNA的保守性，对其进行了大量研究工作，现在已对16S rDNA序列有了清晰的认识[11]16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因,长度约为1500 bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相间的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，是生物的种属鉴定和系统发育的重要分子基础目前，rRNA分子己经成为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，加上大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的从而精确地揭示了微生物种类和遗传特征的多样性[12]。

近几年来，我国的微生物肥料生产发展较快，但在生产应用中反映出一些问题，如有的菌种质量不好，肥效不高，微生物肥料的品种也不多[13]发展微生物肥料，重要的一个方向是要应用现代生物技术筛选出高效、抗逆、强竞争存活能力的菌株，以适应微生物肥料发展的需要[14]本文先从未喷洒，喷洒国产和喷洒加拿大菌剂后的三种大豆根的根瘤中分离出革兰氏阴性菌株，再利用16S rDNA分子鉴定筛选出慢生型大豆根瘤菌，与原菌剂中的菌株比较同源性，验证该菌株是原菌剂中的根瘤菌，从而证明该菌株可以引起大豆根结瘤2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 大豆根大豆根1：未喷洒任何根瘤菌剂所生长的大豆根大豆根2：喷洒国产根瘤菌剂所生长的大豆根大豆根3：喷洒加拿大根瘤菌剂所生长的大豆根三种大豆根均来自黑龙江九三试验田2.1.2 培养基 YEM培养基：甘露醇10 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，酵母粉0.4 g，蒸馏水1 L，pH 6.8，121 ℃灭菌30 min2.1.3 主要试剂2.1.3.1 主要试剂盒细菌基因组提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，试剂盒组成为：Buffer GTL，Buffer GL，Buffer GW1，Buffer GW2，Buffer GE。

2.1.3.2 主要试剂及其配制结晶紫染液：结晶紫1 g，95%乙醇20 mL，1%草酸铵水溶液80 mL；将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混和路哥氏碘液：碘片1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 mL；将碘与碘化钾先进行混和，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL沙黄复染色液：沙黄0.25 g，95%的乙醇10 mL，将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释至100 mL0.5 mol/L EDTA： 称取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L烧杯中，加入约800 mL的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约20 g NaOH，pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解），加去离子水将溶液定容至1 L，适量分成小份后，高温高压灭菌，室温保存冷无水乙醇：将无水乙醇置于-20 ℃保存 TAE电泳缓冲液：（1）50×贮存液：Tris碱24.2 g；冰醋酸5.71 mL；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），10 mL；加60 mL蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至100 mL，浓盐酸调pH至8.02）1×工作液：将以上贮存液用蒸馏水稀释50倍。

做电泳缓冲液 50%甘油：取甘油和蒸馏水等比例混合，121 ℃灭菌20 min备用goldviewTM核酸染料：用量筒量取350 mL 1×TAE，加入100 µL goldviewTM，混合均匀后，妥善保存2.1.3.3 其他试剂Taq酶、10×Buffer、dNTPs、Marker DM2000等购自北京康为世纪生物科技有限公司PCR扩增的引物购自华大基因电泳所用Loading Dye购自东洋纺生物科技有限公司2.1.4 主要仪器 FA2004电子天平上海精科天平TGL-16G高速台式离心机上海安亭科学仪器公司BCM-1000A生物洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司XW-80A涡旋混合器江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司MCO-15A CO2 培养箱SANYO Electric Co.Ltd.可调试移液器热电（上海）仪器有限公司Motic Digital Microscope OlipusHNY-2102 INCUBATOR SHAKER天津市欧诺仪器仪表有限公司DYY-2C型电泳仪北京六一仪器厂130XUN型立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂多用全封闭电炉河北省黄骅市振兴电器仪器厂WD-9403F紫外仪北京六一仪器厂BCD-241WE/Y冰箱青岛海尔特种电冰箱有限公司HH-Z4型恒温水浴锅郑州长城科工贸有限公司Tgradient梯度PCR仪德国Biometra公司MG-5005D微波炉天津乐金电子电器有限公司KYC 100C INCUBATOR SHAKER上海福玛实验设备有限公司2.2 实验方法2.2.1 大豆根根瘤预处理2.2.1.1 大豆根预处理先将取回的大豆根于清水中浸泡数分钟，使根部泥土松动。

在水中轻轻摇晃依次重复3次，直到根部泥土清理干净为止然后室温晾干，拍照，比对2.2.1.2 根瘤的处理剪取较大的根瘤剪取根瘤时注意将根瘤所在的根部0.5cm左右一同剪取防止根瘤与根的连接部位污染）将剪取的根瘤在清水中冲洗3-4次去除缝隙中的泥土，在超净工作台内再用70%酒精擦洗，并在其中浸泡3分钟，用无菌水冲洗，除去表面的酒精用灭过菌的镊子轻轻取下根瘤，灭过菌的小刀将根瘤切开切面贴于固体YEN培养基上，并划线2.2.2 根瘤菌的纯化和形态观察2.2.2.1 根瘤菌剂中菌株的纯化和菌落形态观察依据上述方法依次处理三种根瘤每种根瘤取一个完整根瘤放于YEM培养基上作为阴性对照将平板倒置与30℃恒温培养每12h观察一次待长出单菌落后，挑取单菌落与新的YEM培养基上分区划线重复该步骤，知道平板上出现的菌落形态单一为止观察出现单菌落的形态从大豆根1中分离出的单菌记为c11，c12，c13，c14，c15，从大豆根2的根瘤中分离出的单菌记为A12，A14，从大豆根3的根瘤中分离出的单菌记为c21，c22，c232.2.2.2 革兰氏染色制片：在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用灭菌的接种环挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合成悬液；固定：在酒精灯火焰外层快速地来回通过3~4次，完全干燥；染色：结晶紫染色1 min后水洗；媒染：加路哥氏碘液作用1 min后水洗、吸干残液；脱色：用95%乙醇脱色直至滴加的酒精不成紫色为止；水洗：用水滴洗去乙醇，吸干残液；复染：加0.5%的番红染色液染色10~30 s后，用自来水冲洗；干燥后置于显微镜下观察染，显现紫色的为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。

为了使实验结果更可靠，将大肠杆菌（革兰氏阴性菌）、慢生大豆根瘤菌以及枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）制片于同一载玻片上，进行以上操作选取最后的革兰氏阴性细菌进行一下步骤2.2.3 纯化菌株基因组的提取取2.2.2.3中革兰氏阴性菌株的培养物少许分别接种在YEM的液体试管中置于30 ℃，150 rpm摇床培养，至培养液混浊按照基因组提取试剂盒中操作说明提取选取的革兰氏阴性菌株革兰氏阴性菌提取基因组的步骤：①对以上培养液进行镜检，确定无杂菌后取适量的菌液加入1.5 mL离心管中离心，7500 rpm，10 min尽量除净上清液②向离心管中加入200 μL的蛋白酶K，涡旋混匀56 ℃水浴至菌体完全裂解期间每隔一段时间颠倒混匀③涡旋震荡15 s，向其加入200 μL的Buffer GL，涡旋振荡混匀，再加入200μL无水冰乙醇，涡旋混匀④将③中所得的全部溶液转移到Spin Column DM中（Spin Column DM已经放入Collection Tube中）⑤8000 rpm离心1分钟，弃去废液，将Spin Column DM放回Collection Tube中⑥加入500 μL的Buffer GW1，8000 rpm离心1分钟，弃去废液。

⑦加入500 μL的Buffer GW2，14000 rpm离心1分钟，弃去废液⑧14000 rpm离心2分钟，弃去废液将Spin Column DM置于室温数分。