免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析.课件.ppt

免疫组化、免疫荧光、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用流式细胞术的应用(yìngyòng)(yìngyòng)比较比较及常见问题分析及常见问题分析宋砚明宋砚明第一页，共三十五页Ø免疫组化免疫组化（（IHC））的应用介绍的应用介绍(jièshào)(jièshào)Ø免疫荧光免疫荧光（（IF））的应用介绍的应用介绍Ø流式细胞术流式细胞术（（FC））的应用介绍的应用介绍ØIHC、、IF、、FC区别与联系区别与联系第二页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫组织化学原理及特点免疫组织化学原理及特点Ø利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测(jiǎn cè)的一门技术Ø免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点免疫免疫(miǎnyì)(miǎnyì)组织化学组织化学（（Immunohistochemistry, IHC））第三页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..细细 胞胞抗抗原原(kàn(kàngyuágyuán)n)一一抗抗二二抗抗辣根过氧化物(ɡuò yǎnɡ huà wù)酶（HRP）3 3，，3-3-二氨联苯胺（二氨联苯胺（DABDAB）显色剂）显色剂棕褐色(hè sè)络合物IHC反反应应原原理理示示意意图图第四页，共三十五页。

免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..组织切片组织切片/芯片芯片(xīn piàn)制作制作第五页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..2. 组织芯片应用领域组织芯片应用领域组织芯片的应用(yìngyòng)领域包括与生命科学相关的基础研究、临床研究、应用(yìngyòng)研究和新药开发等Ø免疫组化染色（IHC）；Ø原位杂交（ISH）；Ø荧光原位杂交（FISH）；Ø原位末端标记分析（TUNEL）；Ø原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅助的cDNA杂交1. 组织芯片组织芯片Ø组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体(zàitǐ)上，组织芯片中含有蛋白，RNA及DAN分子，是一种高通量的研究分析工具研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的关系3. Abgent 现有组织切片现有组织切片/ /芯片产品芯片产品Ø全套鼠类器官组织切片；Ø全套猴类器官组织切片；Ø人类(rénlèi)常见癌症组织切片；Ø组织芯片客户定制服务组织芯片组织芯片/切片应用切片应用第六页，共三十五页。

免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫组化流程免疫组化流程(liúchéng)示意图示意图第七页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..2. SP法法Ø原理：原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计在一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后，生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成(xíngchéng)抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记的链霉亲和素复合物Ø特点：特点：该法孵育时间短（通常为10min），灵敏度高以及低背景染色等特点1. SABC法法Ø原理：原理：SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与链酶亲和素按一定比例(bǐlì)混合，形成SABC复合物用生物素化二抗与第一抗体结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗体～生物素化二抗～ SABC复合物最后用底物显色剂显色。

Ø特点：特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点3. Polymer酶标二抗法酶标二抗法Ø原理：原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个HRP/AP酶分子，所以(suǒyǐ)同样具有很高的信号放大作用Ø特点：特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进行内源性的生物素封闭IHC二抗原理及选择二抗原理及选择4. 直接酶标二抗法直接酶标二抗法Ø该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上因此需要普通的酶标二抗即可完成实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到第八页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..IHC常用常用(chánɡ yònɡ)酶标二抗原理示意图酶标二抗原理示意图第九页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..2. AEC显色法显色法Ø产品描述：产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(kā zuò)(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中复染和封片。

本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC显色原和与之配套的稀释液Ø试剂盒组成：试剂盒组成：AEC显色原（试剂A）      AEC底物缓冲液（试剂B）1. DAB显色法显色法Ø产品描述：产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’-diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统(xìtǒng)的免疫组化显色Ø试剂盒组成：试剂盒组成：DAB显色原（20×）（试剂A）      DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）3. BCIP/NBT显色法显色法Ø产品描述：产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组分溶液(róngyè)，用于免疫组化、原位杂交、western blot、northern blot和southern blot，特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色物质Ø试剂盒组成：试剂盒组成：有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑IHC显色方法原理及选择显色方法原理及选择4. BCIP/INT显色法显色法Ø产品描述：产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、western blot、northern blot和southern blot，特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐色物质。

Ø 试剂盒组成：试剂盒组成：有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑第十页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫组织化学结果免疫组织化学结果(jiē guǒ)(jiē guǒ)分分析析第十一页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..2.非特异性显色非特异性显色Ø石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间Ø操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的次数(cìshù)与冲洗时间Ø组织富含内源性的生物素与过氧化物酶，建议使用相关试剂进行封闭Ø发生抗原异位Ø蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间1.显色过深显色过深Ø一抗浓度(nóngdù)过高或孵育时间过长，建议降低一抗浓度(nóngdù)或减少孵育时间Ø孵育温度过高，建议室温或4℃孵育ØHRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时间3.显色强度弱显色强度弱Ø一抗浓度过低或孵育时间(shíjiān)过短，建议增加一抗浓度或延长孵育时间(shíjiān)Ø试剂超过保质期，建议实验前确认试剂的保质期Ø操作过程冲洗过度，建议适度冲洗免疫组织化学常见问题分析免疫组织化学常见问题分析4.无染色无染色Ø组织中无目的抗原的表达。

Ø一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前确认一抗的种属来源Ø显色物质与HRP系统不匹配，建议实验前确认显色体系第十二页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫荧光原理及特点免疫荧光原理及特点Ø免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技术用免疫荧光显示(xiǎnshì)和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术Ø免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点免疫荧光免疫荧光（（Immunofluorescence, IF））第十三页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫荧光原理免疫荧光原理(yuánlǐ)示意图示意图第十四页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫荧光实验免疫荧光实验(shíyàn)(shíyàn)过程过程 细胞爬片（多聚赖氨酸处理细胞爬片（多聚赖氨酸处理(chǔlǐ)(chǔlǐ)，生长密度，生长密度70-80%70-80%）） 细胞固定（合适的固定液，如细胞固定（合适的固定液，如4%4%甲醛溶液等）甲醛溶液等） 细胞膜穿透（细胞膜穿透（ Triton X-100 Triton X-100 等）等） 封闭（封闭（3%BSA-PBS3%BSA-PBS等）等） 一抗孵育一抗孵育 荧光二抗孵育荧光二抗孵育 胞浆胞浆/ /核衬染（鬼笔环肽核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI/DAPI/PI）） 封片荧光显微镜拍照封片荧光显微镜拍照 第十五页，共三十五页。

免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫荧光结果免疫荧光结果(jiē guǒ)(jiē guǒ)分析分析第十六页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..免疫荧光双染色免疫荧光双染色(rǎnsè)(rǎnsè)抗体的选择抗体的选择直接法：直接法：Ø一抗种属来源无要求Ø标记两种不同(bù tónɡ)荧光素的一抗间接法：间接法：Ø一抗种属来源来源不同(bù tónɡ)Ø二抗分别标记不同荧光素第十七页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..细胞核衬染染料：细胞核衬染染料：ØDAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料它可以透过完整的细胞膜，因此以用于活细胞和固定细胞的染色最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色ØHoechst 33342 是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在紫外激发(jīfā)光作用下发出兰色荧光.能够透过完整的细胞膜，可用于活细胞染色Ø碘化丙啶碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm细胞浆衬染染料：细胞浆衬染染料：Ø鬼笔环肽鬼笔环肽（（phalloidin ））由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种环肽可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定其荧光标记物是鉴定F肌动蛋白的重要试剂荧光抗体的选择：荧光抗体的选择：Ø绿色荧光素：绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等Ø红色荧光素：红色荧光素：PE，Alex546等各种荧光染料原理各种荧光染料原理(yuánlǐ)及及选择选择第十八页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..2.信号弱或无信号信号弱或无信号Ø无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达量高的细胞或组织Ø细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时间或浓度Ø一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度Ø二抗选择错误(cuòwù)（种属不匹配），建议选用与一抗种属相匹配的二抗1.背景过高背景过高Ø一抗质量不高，建议(jiànyì)使用特异性高、效价高的一抗Ø一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗浓度Ø封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间Ø洗涤不充分，建议增加冲洗次数与时间。

Ø可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景3.荧光猝灭快荧光猝灭快Ø荧光素本身特性决定，光稳定性差，建议选用光稳定性好的荧光素二抗Ø用普通(pǔtōng)的封片剂封片，建议选用防荧光猝灭剂封片免疫荧光常见问题分析免疫荧光常见问题分析4.细胞有自发荧光细胞有自发荧光Ø使用了戊二醛固定，建议在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光Ø材料本身（如石蜡）有自发荧光，建议设立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色  Ø细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细胞中死细胞／活细胞比例高；第十九页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..流式细胞术定义及原理流式细胞术定义及原理Ø流式细胞仪流式细胞仪（（FLOW CYTOMETOR）：）： 进行流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学(huàxué)，抗体技术为一体的高科技细胞分析仪Ø流式细胞术流式细胞术（（FLOW CYTOMETRY））: 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。

流式细胞术流式细胞术（（Flow Cytometry, FC））第二十页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..细细 胞胞抗抗原原(kàn(kàngyuágyuán)n)一一抗抗二二抗抗荧光荧光(yíngguāng)(yíngguāng)物质物质（（FITC,PEFITC,PE等）等）不同不同(bù tónɡ)(bù tónɡ)颜色的激发光颜色的激发光F FC C反反应应原原理理示示意意图图激光源激光源转化为计算机识别转化为计算机识别数据数据第二十一页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..流式细胞仪工作流式细胞仪工作(gōngzuò)(gōngzuò)原理原理图图第二十二页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..第二十三页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..流式细胞术实验流式细胞术实验(shíyàn)(shíyàn)过程过程 细胞细胞(xìbāo)(xìbāo)悬浮液制备（浓度为悬浮液制备（浓度为1 1～～5 5×106个个/ml）） 细胞固定（合适的固定液，如细胞固定（合适的固定液，如4%4%甲醛溶液等）甲醛溶液等） 细胞膜穿透（细胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等）冰冷的甲醇等） 封闭（封闭（3%BSA-PBS3%BSA-PBS等）等） 一抗孵育一抗孵育 荧光二抗孵育荧光二抗孵育 流式细胞仪分析流式细胞仪分析第二十四页，共三十五页。

免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..人外周全人外周全(zhōuquán)(zhōuquán)血细胞双参数散血细胞双参数散点图点图直方图：单参数直方图：单参数(cānshù)(cānshù)分析分析流式细胞术常见结果流式细胞术常见结果(jiē guǒ)(jiē guǒ)分分析析第二十五页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..散点图：多参数散点图：多参数(cānshù)分析分析常用常用(chánɡ yònɡ)(chánɡ yònɡ)细胞表型及意义：细胞表型及意义：（（Cluster of Differentiation, CD））CD3 总总T T细胞细胞CD4 T T辅助辅助/ /诱导细胞亚群诱导细胞亚群CD8 T T抑制抑制/ /细胞毒细胞亚群细胞毒细胞亚群CD19 B B细胞抗原细胞抗原LL: CD3CD3- -CD4CD4- - B B细胞细胞(xìbāo)(xìbāo)群群+ +细胞细胞毒毒T T细胞亚群细胞亚群LR：：CD3CD3+ +CD4CD4- - 细胞毒细胞毒T T细胞亚群细胞亚群UR：：CD3CD3+ +CD4CD4+ + T T辅助细胞亚群辅助细胞亚群UL 0.70 UR 24.2LR22.3LL 52.80 第二十六页，共三十五页。

免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..荧光补偿荧光补偿(bǔcháng)示原理示原理Ø荧光补偿是指修正(xiūzhèng)荧光渗漏的过程，如从探测器出去除匹配荧光以外的任何荧光信号Ø当采用两种或两种以上荧光标记时（如FITC,PE），当携带两种荧光素的细胞受到激光照射激发时，将发出两种不同波长的荧光然而，荧光染料所发出的荧光都具有一定的波长范围（宽发射谱性质），虽然各自的荧光峰值不同，但发射谱范围会有一定的重叠因而就会造成不同通道之间的荧光干扰，对实验结果造成影响第二十七页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..荧光荧光(yíngguāng)补偿示意图补偿示意图第二十八页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..Annexin V-FITC/PI凋亡凋亡(diāo wánɡ)检测原理检测原理•在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中•Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。

•将Annexin V进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的Annexin V-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生•碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡中晚期的细胞和死细胞，碘化丙啶PI能够透过细胞膜而使细胞核红染因此将 Annexin V 与PI 匹配使用，就可以(kěyǐ)将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来第二十九页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..图片(túpiàn)引自  第三十页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..Annexin V-FITC /PI 凋亡凋亡(diāo wánɡ)检测结果分析检测结果分析第三十一页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..荧光强度荧光强度/ /背景过高背景过高Ø一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗浓度Ø封闭不完全(wánquán)，建议增加蛋白封闭时间Ø洗涤不充分，建议增加冲洗次数与时间信号弱或无信号信号弱或无信号Ø无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达量高的细胞。

Ø细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时间或浓度Ø一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度Ø二抗选择错误（种属不匹配），建议选用与一抗种属相匹配的二抗柱形图分析时出现荧光双峰柱形图分析时出现荧光双峰Ø抗原本身特性所决定（比如不同时期的细胞蛋白表达量不同）Ø进样针堵塞，建议清洗管路Ø进样速度太快，建议调低进样速度Ø管路系统偏移导致焦距偏离，建议请专业维修人员校准  流式细胞术常见问题分析流式细胞术常见问题分析(fēnxī)(fēnxī)第三十二页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..IHC、、IF、、FC区别区别(qūbié)(qūbié)与联与联系系FCFC IHC/IF IHC/IF控制控制电脑（客观）人（主观） 结果显示方式结果显示方式荧光激发后被探测子捕获信号化学显色/荧光通过显微镜观察拍片样本样本单细胞（或颗粒）悬液（流动）组织切片/细胞爬片（静止）细胞数量细胞数量大（上万个）小样本利用样本利用分选后可回收利用不可回收利用结果揭示信息结果揭示信息细胞群体特征分布 揭示细胞内部结构信息功能功能可同时检测多个参数一般只能检测一个参数第三十三页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..第三十四页，共三十五页。

免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..内容(nèiróng)总结免疫组化、免疫荧光、操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的次数与冲洗时间操作过程冲洗过度，建议适度(shìdù)冲洗一抗种属来源来源不同可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间用普通的封片剂封片，建议选用防荧光猝灭剂封片进样速度太快，建议调低进样速度一般只能检测一个参数第三十五页，共三十五页免疫组化免疫荧光流式细胞术的应用比较及常见问题分析..。