疫组化4双重或多重标记ppt课件.ppt

双重或多重免疫组化标志双重或多重免疫组化标志一、根本原理一、根本原理 双重或多重标志是利用免双重或多重标志是利用免疫学和细胞化学原理，在同一疫学和细胞化学原理，在同一张切片上原位示踪组织或细胞张切片上原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项内不同抗原大分子物质的一项标志染色技术标志染色技术示踪剂：示踪剂：------荧光素荧光素 --- ---酶酶 --- ---胶体金等胶体金等操作的原那么和要求根本上与单标免疫组操作的原那么和要求根本上与单标免疫组化方法雷同化方法雷同优点：不同抗原成分位置、功能关系更直优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观观缺陷：流程长缺陷：流程长 脱片机率更高脱片机率更高 前后重染色试剂间有交叉干扰前后重染色试剂间有交叉干扰二、技术类型二、技术类型〔一〕双重或多重免疫荧光标志染色〔一〕双重或多重免疫荧光标志染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标志不同的抗体，再经过各自与同一分别标志不同的抗体，再经过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。

色技术优点：方法敏感、特异优点：方法敏感、特异缺陷：缺陷：需选用各自特定的激发滤光片分别察看或需选用各自特定的激发滤光片分别察看或二次曝光显影二次曝光显影样本不能长期保管样本不能长期保管组织构造背景不明晰组织构造背景不明晰直接法直接法---特异、快速特异、快速 间接法间接法---敏感、多用敏感、多用 技术类型抗体试剂抗体试剂异种动物抗体异种动物抗体---常混合运用，操常混合运用，操作步骤少，脱片率相对较低作步骤少，脱片率相对较低同种动物抗体同种动物抗体---分别运用，操作步分别运用，操作步骤加倍，脱片机率较高；前后重免疫骤加倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标志交叉重叠时机多，需用酸性荧光标志交叉重叠时机多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处置洗脱或多聚甲醛蒸气处置 操作举例：垂体腺瘤操作举例：垂体腺瘤----ACTH与与GH双重免疫荧光标志染色〔间接法〕双重免疫荧光标志染色〔间接法〕(1)石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化，入石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化，入PBS2)1％人血洁白蛋白〔％人血洁白蛋白〔HAS〕孵育〕孵育10min(3)抗抗ACTH血清〔血清〔McAb〕〕1:200，孵育，孵育(4)0.05mol/L TBS洗洗(5)羊抗鼠羊抗鼠IgG-TRITC ，避光反响，避光反响1h。

6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗洗 (第一重第一重ACTH-TRITC标志染色已完成志染色已完成)7)切片脱水，二甲苯透明，空气枯燥后，置于装有切片脱水，二甲苯透明，空气枯燥后，置于装有多聚甲多聚甲醛粉末的密粉末的密闭容器内，放在容器内，放在80℃烤箱或温箱烤箱或温箱内以甲内以甲醛蒸气固定蒸气固定2～～4h，使第一重染色中二抗的，使第一重染色中二抗的抗原抗原结合部位失活合部位失活(8)切片以切片以TBS洗洗(9)1％％ HSA孵育孵育30min (10)抗抗GH血清血清(McAb) 1:400，孵育，孵育30min(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗洗(12)羊抗鼠羊抗鼠IgG-FITC ，避光反响，避光反响1h13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗洗 (第二重第二重GH-FITC标志染色完成标志染色完成)14)缓冲甘油封片缓冲甘油封片(15)荧光显微镜下分别以荧光显微镜下分别以546nm及及490nm波长的激发波长的激发光察看切片组织内光察看切片组织内TRITC及及FITC所标示的所标示的ACTH及及GH抗原〔抗原〔TRITC阳性细胞呈红色，阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞阳性细胞呈绿色〕。

呈绿色〕16)用彩色底片对切片同一部位用用彩色底片对切片同一部位用546nm及及490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的显示不同颜色标示的ACTH与与GH两种抗原两种抗原TRITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人ACTH〔〔IgG〕〕FITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人GH〔〔IgG〕〕T游离游离FabTTTFGH抗原抗原ACTH抗原抗原FFab被灭活被灭活图图1 同种动物抗体间接法〔分步固定〕双重免疫荧光荧色原理同种动物抗体间接法〔分步固定〕双重免疫荧光荧色原理〔二〕双重或多重免疫酶标志染色〔二〕双重或多重免疫酶标志染色 以酶催化不同底物呈现不同颜色以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为实际根底所建立起来的多重免疫标志染为实际根底所建立起来的多重免疫标志染色方法优点：光镜下可以同时察看和对比优点：光镜下可以同时察看和对比 一次曝光即可成像一次曝光即可成像 样品保管时间相对较长样品保管时间相对较长 ★★常用常用标志志酶与底物的配伍与底物的配伍 单酶双底物双底物 DAB(棕色棕色):4CN(蓝色色) AEC(红色色):4CN(蓝色色) 巩固巩固红(fast red 红色色) 巩固巩固蓝(fast blue 蓝色色)HRPAP-萘酚萘酚AS-MX双酶双底物双酶双底物 HRP(DAB):AP(萘酚萘酚AS.MX-巩固蓝巩固蓝) HRP(4CN):AP(萘酚萘酚AS.MX-巩固红巩固红)直接法、间接法、桥法均可运用直接法、间接法、桥法均可运用灵敏度以桥法中的复合物法最高灵敏度以桥法中的复合物法最高特异性那么以直接法最正确特异性那么以直接法最正确 操作方法操作方法类同同单酶标志，有直接法、志，有直接法、间接法、复合物法之分。

接法、复合物法之分 间接法与复合物法接法与复合物法较常采用 ★★操作操作举例例 淋巴瘤淋巴瘤轻链κ、、λ的双重的双重酶标志〔双志〔双酶双底物〕双底物〕(1)石蜡切片常规脱蜡进水〔假设用含汞石蜡切片常规脱蜡进水〔假设用含汞固定液固定的组织那么需用固定液固定的组织那么需用0.5%碘的乙醇碘的乙醇溶液脱汞溶液脱汞5min，乙醇浓度为，乙醇浓度为70％，经自来％，经自来水洗后，以水洗后，以2.5%硫代硫到钠浸洗硫代硫到钠浸洗1min，水，水洗洗)；；(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片甲醇液浸泡切片30min,自来自来水洗，蒸馏水洗水洗，蒸馏水洗,入入PBS(0.01mol/L pH7.2);(3)滴加正羊血清滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，，湿盒，室温，10min，不洗；，不洗；(4)加一抗加一抗(抗人抗人κ PcAb与抗人与抗人λMcAb的混的混合液合液)1:200，湿盒，，湿盒，37℃，，45min或更或更长；；(5)PBS液，液，5min×3(6)加二抗加二抗(GARG＋＋GAMG混合液混合液1:200)，，温盒，温盒，37℃，，30min；；(7)PBS洗，洗，5min×3;(8)加加酶抗抗酶抗体复合物抗体复合物(兔兔PAP＋鼠＋鼠APAAP 混合液混合液1:100)，湿盒，，湿盒，37℃，，30min；；(9)PBS洗，洗，5min×3；；(10)过氧化物氧化物酶显色反响：以色反响：以DAB- H2O2液液显色色 7～～10min(镜下控制下控制显色程度色程度)，，PBS洗，洗，5min×3；；(11)硷性磷酸性磷酸酶显色反响：以色反响：以萘酚酚AS.MX及巩固及巩固蓝(fast blue)显色色10～～15min(镜下下控制控制显色程度色程度)，，PBS洗、自来水洗；洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光冲甘油封片，光镜下察看下察看PPPAAA κ λ图图2 双酶双底物双酶双底物(复合物法复合物法)双重酶标染色原理双重酶标染色原理兔兔PAPGAR IgG兔抗兔抗KAg鼠鼠APAAPGAM. IgG鼠抗人鼠抗人注：假注：假设用同种用同种动物抗血清分物抗血清分别进展展标志染色志染色时，尚需思索在前后重染色之，尚需思索在前后重染色之间能否能否设置置“多多聚甲聚甲醛蒸气蒸气处置置2-4h〔封〔封锁固定〕或用固定〕或用pH2.2的甘氨酸的甘氨酸---盐酸溶液酸溶液处置置2h〔酸洗脱〕的操作〔酸洗脱〕的操作步步骤〞，目的〞，目的为了防止前后重免疫了防止前后重免疫试剂间的交的交叉反响。

可叉反响可视预实验结果来确定果来确定〔三〕双重及多重免疫金标志〔三〕双重及多重免疫金标志(电镜〕电镜〕 电镜下的双重免疫标志染色不是靠电镜下的双重免疫标志染色不是靠颜色区分，而是靠标志物的不同电子密颜色区分，而是靠标志物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标志方法有别于光镜下的双重免疫标志方法 常用的方法多为双重免疫金标志常用的方法多为双重免疫金标志 优点：高电子密度，分辨率高，抗原定优点：高电子密度，分辨率高，抗原定 位准确，颗粒大小可人工控制，位准确，颗粒大小可人工控制， 标志试剂易制备标志试剂易制备 缺陷：试剂质量要求高，非特异吸附干扰缺陷：试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大大(背景背景) 金标抗体双重抗原标志常用间接法显金标抗体双重抗原标志常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作示，且多采用异种动物抗体混合同步操作优点：敏感性提高，操作步骤减少优点：敏感性提高，操作步骤减少缺陷：标志二抗质量要求高，背景染色深。

缺陷：标志二抗质量要求高，背景染色深 可经过采用固相吸附或过量二抗封锁，可经过采用固相吸附或过量二抗封锁，或用多聚甲醛蒸气处置，使二抗的游离抗或用多聚甲醛蒸气处置，使二抗的游离抗原结合部位〔原结合部位〔Fab段〕灭活加以抑制段〕灭活加以抑制〔四〕其它双重标志法〔四〕其它双重标志法 1. 1.免疫荧光法与免疫酶法结合运用免疫荧光法与免疫酶法结合运用( (先酶先酶标标 后荧光后荧光) ) ；； 2. 2.免疫荧光法与免疫金银法结合运用免疫荧光法与免疫金银法结合运用( (先先免疫金银标志后荧光标志免疫金银标志后荧光标志) ) ；；3.3.免疫酶法与免疫金法结合运用免疫酶法与免疫金法结合运用(20nm,(20nm,红红 色〕，此法忌用银液放大，易吸附干扰；色〕，此法忌用银液放大，易吸附干扰；4.4.免疫金银法与免疫酶法结合运用免疫金银法与免疫酶法结合运用( (对比明对比明 显显) ) 三、本卷须知三、本卷须知 1.标志染色的顺序确定需视组织标标志染色的顺序确定需视组织标志抗原的性质，量少、脆弱先标志，志抗原的性质，量少、脆弱先标志，量多、耐受后标志。

量多、耐受后标志 2.构造保管与抗原维护并重，电镜构造保管与抗原维护并重，电镜样品普通忌用饿酸后固定，样品普通忌用饿酸后固定，PG固固定液中的戊二醛定液中的戊二醛(G)浓度不宜超越浓度不宜超越2％，光镜样品的固定剂类型和固定％，光镜样品的固定剂类型和固定时间的选择也应如此；时间的选择也应如此；3.严厉操操作作步步骤，，轻柔柔，，洗洗涤应彻底底，，洗洗涤用用的的TBS中中常常参参与与1％％ Triton×100或或Saponin；； 4.保保证试剂的的清清洁度度与与纯度度(双双蒸蒸水水，，亲和和免免疫疫层析析)，，留留意意加加强组织片片与与载玻玻片片的的粘粘合合 度度 ，， 以以 减减 少少 脱脱 片片 机机 率率 ；；5. 封封片片剂选择应留留意意显色色剂的的溶溶解解特特性性，，普普通通多多采采用用水水封封片片(10%缓冲冲甘甘油油)，，保保管管时间不不长，，应及及时察看察看记录。