一立项依据与研究内容.doc

〔一〕 立项依据与研究内容1. 工程的立项依据 〔研究意义、 国内外研究现状及分析， 附主要参考文献目录 〕杆状病毒是一类基因组大小在 80〜180kb之间的双链超螺旋杆状 DNA病毒，因其病毒粒子的外形呈棒状而得名 [1]杆状病毒的研究原来侧重于作为重要的生物防治微生物控制森林害虫的虫口密度和作为重要绢丝昆虫的病源微生物减轻在蚕丝业上的危害性 [2] 自发现杆状病毒的多角体蛋白启动子为真核生物中具有最强转录活性的启动子之一这一特性后， 构建成高效的真核生物表达系统——杆状病毒表达系统以来， 随着杆状病毒分子生物学研究的进展， 目前已有超过 20 个的杆状病毒基因组全序列完成 [3]，为进一步开展功能基因研究提供了根底 目前其研究和应用领域已拓展到真核生物外表展示系统， 蛋白质－—蛋白质互作研究系统， 杆状病毒介导的哺乳动物外源基因转导和疫苗开发及基因治疗等新领域 [4]杆状病毒基因表达调控的根本模式为级联表达模式：亦即后一时相的基因表达有赖于前一时相基因的有效表达， 目前一般仍认为杆状病毒基因表达可分为4个阶段：I:极早期基因：以IE-1为代表的全程反式调控因子；H:早期基因：参与病毒 DNA 复制的一些基因，如 DNA 聚合酶、解旋酶等，这些基因的启动子可被宿主的 RNA 聚合酶所识别和转录，但转录活性很低，大量转录仍有赖于极早期基因的参与〔注：亦有将I、R统称为早期基因，但从一些基 因启动子功能分析和Northern杂交结果来看，可能还是分开更为合理〕；田：晚 期基因：多为一些病毒核衣壳的结构蛋白及参与病毒复制形成的一些辅助蛋白，如egt、gp64、ubiquitin等；IV:晚晚期基因，只在病毒感染的末期进行超高量表达，与病毒包含体的形成有关，目前直接参与影响晚晚期基因多角体蛋白和p10 蛋白表达的已鉴定的只有 VLF-1 蛋白〔 Very Late Factor-1〕 [5]。

虽然目前已有至少 23 个杆状病毒的全基因组序列得到了分析，所包含的 DNA 序列长度在80〜180kb之间，所预测的ORF数目在90〜181之间，但其中仍有不少 ORF的功能未得到明确鉴定 [6]在 90年代中期， Miller 实验室建立了一套方法鉴定晚期基因表达因子〔Late gene Expression factor, lef的方法：具体过程通过构建一个含 12 个长片段且互相重叠， 包含整个病毒基因组文库， 以晚期基因 vp39 和晚晚期基因多角体蛋白基因的启动子为靶启动子， 通过缺减其中任一个长片段的方法来鉴定晚期基因表达因子 [7]至目前已经鉴定出 12 个晚期基因表达因子[8][9][10][11] ， 但这一方法仍有一些可待改进之处： ①如有些晚期基因表达因子，作用于晚期基因的表达， 但它的缺少并不影响晚期基因的表达， 即其作用可被替代的晚期基因表达因子就很难鉴定出来； ②很难对作用于早期基因启动子的反式因子进行分析 ; ③很难分析清楚影响晚期基因表达的转录调控途径； ④一次参与转染的 DNA 片断数太多，对操作技术的要求很高，同时片断长度太长，后续操作分析鉴定工作量大。

所以从 1998 年迄今，未有新的晚期基因表达因子鉴定出来 [12]鉴于此，我们从另一个相反的角度出发，建立了一个杆状病毒反式作用因子的全基因组扫描技术体系： 即首先建立一个覆盖度至少为杆状病毒全基因组大小6倍以上的随机文库(300〜500个质粒)，同时克隆包含所有杆状病毒极早期基因片断的质粒 ; 然后将早期或晚期靶基因启动子的报告质粒 DNA 进行与每个文库质粒 DNA 或每个文库质粒与极早期基因质粒 DNA 进行共转染，通过分析启动子的转录活性强度以鉴定反式作用因子 我们选定的杆状病毒为目前研究最为透彻的两个代表种：苜蓿尺蠖核型多角体病毒( Autographa californicaNucleopolyhedrovirus, AcNPV ) 和 家 蚕 核 型 多 角 体 病 毒 ( Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus, BmNPV)初步选定的靶基因启动子为：解旋酶和 DNA聚 合酶(DNA polymerase基因启动子，是病毒DNA复制的关键酶[13],亦是早 期基因启动子类的代表；gp64基因为出芽病毒(BV)特有的结构蛋白[14][15]、 egt 基因为杆状病毒基因组中唯一影响宿主昆虫正常生理状态的基因，新近鉴定亦为晚期基因 [16], 、 ubiquitin 基因在所有的多角体病毒中均存在， 同为晚期基因，它参与病毒的形成 , 上述 3 个基因作为晚期基因启动子的代表进行分析； 我们的初步实验证明作用于 helicase基因启动子的极早期基因只有 IE-1,以晚期基因ubiquitin 启动子为目标的反式因子全基因组扫描，鉴定了至少两个新的 ORF 为晚期基因表达因子， 通过对顺式元件增强子的全基因组扫描， 发现了新的反式因子――增强子桥式作用模式， 因此除用于晚期基因表达因子的功能鉴定外， 这一技术体系在理论上适用于所有的顺式元件——反式作用因子的 (DNA-Protein) 互 作研究，亦可应用于具有一定基因组大小的双链 DNA 植物、动物、人类病毒的相关分子生物学机理研究。

主要参考文献：1．吕鸿声 昆虫病毒分子生物学 1998 中国农业科技出版社 , 北京2．吕鸿声 昆虫病毒与昆虫病毒病 1982 科学出版社，3. ． Okano. K, Vanarsdall. AL, Mikhailov. VS, Rohrmann. GF Conserved molecular systems of the Baculoviridae. 2006, Virology. 344:77-874. Kost. TA, Condreay J, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. 2005, Nature Biotechnology 23:567-5755. Mikhailov. VS, Rohrmann. GF. Binding of the baculovirus very late expression (VLF-1) to different DNA structures. 2002, BMC Mol. Biol. 3, 146. Jakubowska AK, Peters SA, Ziemnicka J, Vlak JM, van Oers MM Genome sequence of an enhancin gene-rich nucleopolyhedrovirus (NPV) from Agrotis segetum: collinearity with Spodoptera exigua multiple NPV. J Gen Virol 2006, 87:537-51.7. Passarelli AL, Miller LK Identification and characterization of lef-1, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. 1993, J Virol. 67:3481-8.8. Li Y, Passarelli AL, Miller LK. Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. 1993, J Virol. 67:5260-8.9. Morris TD, Todd JW, Fisher B, Miller LK Identification of lef-7: a baculovirus gene affecting late gene expression. 1994, Virology. 200:360-9.10. Passarelli AL, Miller LK. Identification and transcriptional regulation of the baculovirus lef-6 gene. 1994, J Virol. 68:4458-67.11. Todd JW, Passarelli AL, Miller LK. Eighteen baculovirus genes, including lef-11, p35, 39K, and p47, support late gene expression. 1995, J Virol. 69:968-74.12. Rapp JC, Wilson JA, Miller LK. Nineteen baculovirus open reading frames, including LEF-12, support late gene expression. J Virol. 1998, 72(12):10197-206.13. Xiao QL, Zhang ZF. Identification of functional region of helicase gene promoter in Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus. ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA( 生物化学与生物物理学报 ), 2002, 34:560-56414. Zhou Ya-Jing, Yongzhu Yi, Zhang Zhi-Fang. Promoter activity in thebaculovirus envelope glycoprotein gp64 gene. ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA〔 生物化学与生物物理学报 〕, 2003, 35: 18-2615. Yajing Zhou, Zhifang Zhang. Cetyltriethylammonium bromide stimulating transcription of Bombyx mori nucleopolyhedro- virus gp64 gene promoter mediated by viral factors. Cytotechnology, 2003, 41 :37-4416. Xing-jia Shen, Yong-zhu Yi, Shun-ming Tang, Zhi-fang Zhang , Yi-ren Li, Jia-lu He. The Ecdysteroid UDP-Glucosyltransferase Gene Promoter from Autographa californica Multicapsid Nucleopolyhedrovirus. Zeitschrift fur Naturforschung C , 2004, 59:749-7542、工程的研究内容、研究目标 , 以及拟解决的关键问题 。

2.1 研究内容1. 高质量杆状病毒基因组 DNA 随机质粒文库构建技术的完善在分析病毒基因组大小，基因组结构特性的根底上，通过杆状病毒基因组 DNA 制备技术的改进、局部酶切技术的可控性提高，高效转化技术的。