结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析.doc

1结核分枝杆菌 ESAT-6 诊断抗原基因的克 隆及同源性分析作者：朱佳佳，刘宏鹏，张爱君，丁淑【摘要】 目的 获得结核分枝杆菌 ESAT-6 抗原基因，进行 DNA 测序、同源性分析，为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础 方法 以结核菌标准菌株H37Rv 为模板，通过 PCR 技术扩增出结核分枝杆菌 ESAT-6 抗原基因，将其重组到 pGEM-T 载体后进行序列测定和生物信息学分析 结果 成功扩增出结核分枝杆菌 ESAT-6 抗原基因，测序表明该片段开放阅读框由 288bp 组成，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为 99%，推导编码氨基酸序列同源性为 90% 结论 成功克隆结核分枝杆菌 ESAT-6 基因，测序结果表明该片段阅读框完整 【关键词】 结核分枝杆菌；ESAT-6 基因；克隆；序列分析Abstract: Objective To obtain and analyze characters and homologies of ESAT-6 gene sequence, and lay bases for screening candidate antigen of Mycobacterium tuberculosis. Methods Total RNA was extracted from protoscoles of cysts. The ESAT- 6 gene of Mycobacterium tuberculosis was amplified by PCR and recombined into pGEM-T vector for sequencing and analyzing. Results A DNA sequence with an open reading frame of 288bp had been amplified successfully by PCR . Compared with the DNA sequence published , the homologies were 99% , which deduced that the amino acid sequence of ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis were 90％ identities. Conclusion ESAT-6 gene was cloned successfully. By analyzing the DNA sequence , we can make sure that the segment of amplification is ESAT-6 , and its reading frame is integrity.Key words: mycobacterium tuberculosis; ESAT-6 gene;cloning;sequencing结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。

但现有的结核病2诊断方法多不能达到早期、有效、特异的诊断目的，如细菌学检查虽然是结核病确诊的金标准，但常见阴性结果［1］痰涂片检出率太低，MTB 培养繁琐费时；影像学和临床症状检查很难做到早期发现和大规模普查；免疫学诊断虽因简单、快速、灵敏有较好的发展前景，但缺乏特异性抗原对于 MTB 潜伏感染者的筛查，由于结核菌素纯蛋白衍生物(protein purified derivative,PPD)包含的抗原成分复杂，因而特异性差、实验灵敏度不够因此，寻找结核特异性抗原对结核病诊断至关重要本研究拟通过分子生物学技术手段获得结核分枝杆菌 ESAT-6（6KDa Early Secretory Antigenic Target)基因，并进行序列测定及同源性分析，为其进一步原核表达及相关研究奠定基础1 材料与方法1．1 材料1.1.1 质粒与菌种标准菌株 H37RvDNA 由西安第四军医大学王丽梅博士友情馈赠，pGEM-T 连接载体购自 Promega 公司1.1.2 酶与试剂E.coli JM109 感受态购自北京全式金生物技术公司，X-gal、IPTG、TaqDNA 聚合酶购自 Promega 公司，限制性内切酶 EcoRI、XholI 购自 HIMERx 公司，200bpDNA Marker、λDNA HindⅢ Marker 购自北京华美公司，质粒提取试剂盒、DNA 回收试剂盒购自天根生物工程公司。

1.1.3 PCR 引物3通过互联网 GeneBank 公共数据库检索出结核分枝杆菌 ESAT-6 基因序列（GenBank 序列号：AY208674），分别在起始端和末端设计出一对引物P1: 5'-CTGAATTCATGACAGAGCAGCAGTGG-3' P2: 5'-GTCTCGAGCTATGCGAACATCCCCGC-3'为了便于亚克隆，在引物 1 和引物 2 的两端分别引入了一个 EcoRI 和 XholI酶切位点引物由上海生物工程公司合成1．2 方法1.2.1 聚合酶链反应（PCR）反应组成为：10×Buffer（含 Mg2+）2.5μL, 10mmol dNTP 0.5μL,引物 1 和引物 2各 0.5μL，DNA 2μL，TaqDNA 酶 0.5μL，ddH2O 18.5μL反应条件为：94℃ 4min; 94℃ 30s, 60℃ 30s，72℃ 30s，30 个循环；72℃ 7min待反应结束后，将 PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳，观察结果1.2.2 PCR 产物的纯化与目的基因的克隆用 DNA 回收试剂盒对 PCR 产物切胶回收DNA 与 pGEM-T 载体在 T4 连接酶的作用下，4℃连接过夜。

连接产物转化入 E.coli JM109 感受态细胞，将其涂布于预先铺有(1M)IPTG 和 X-gal 的 YT 平板上 37℃培养过夜1.2.3 重组质粒的酶切鉴定经蓝白斑筛选，挑选白色菌落 ，碱裂解法提取质粒，用 EcoRI、XholI 酶切后经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定41.2.4 DNA 序列测定及特性分析扩增片段重组质粒的序列由上海生物工程公司进行将测序结果在NCBI/GeneBank 数据库进行 BLAST 比较和分析 2 结果2.1 结核分枝杆菌 ESAT-6 目的基因的扩增PCR 成功扩增出特异性 DNA 片段，位于 300bp 左右，与预期结果一致，见图 12.2 ESAT-6/ pGEM-T/JM109 重组质粒的构建及鉴定PCR 产物与 pGEM-T 载体连接，构建了扩增片段/ pGEM-T/JM109 重组克隆体系经酶切鉴定，得到了大约 300bp 的 DNA 片段，见图 22.3 ESAT-6 基因测序结果及同源性比对分析从正反两个方向对插入片段进行测序，双向测序的结果相吻合测序结果显示ESAT-6 目的片段完整开放阅读框由 288bp 组成将序列与 GenBank 中已发表的基因（GenBank 序列号：NC_010612.1）核酸序列进行比较，结果发现有 2 处 2 个碱基有所不同，同源性达 99%（图 3）。

与 GenBank 中已发表的基因（GenBank 序列号：pdb|1WA8|B）氨基酸序列进行比较，同源性达 90%（图 4）Query：ESAT-6 基因序列 Sbjct：GenBank 已发表序列3 讨论ESAT-6 蛋白是一种 MTB 早期分泌蛋白，由 RD1 区基因 Rv3875 编码通过对MTB 的早期培养滤液( STCF)和不同组分进行分析［2］，发现 ESAT-6 蛋白不仅存5在于 STCF，还存在于细胞浆和细胞壁中Brondt 等［3］发现 ESAT-6 蛋白可刺激结核菌感染小鼠的淋巴细胞增殖，并诱导模型小鼠的淋巴细胞有效释放IFNγMartin［4］的研究证明 Query：ESAT-6 基因序列 Sbjct：GenBank 已发表序列 ESAT-6 蛋白可诱导结核菌感染豚鼠产生迟发型超敏反应Pathan 等［5］选用不同程度的 MTB 感染者为实验对象，用 ESAT-6 ELISPOT 方法计数外周血中分泌IFNγ 的 T 细胞，结果发现除了未感染过 MTB 的人群呈阴性反应，其余各组包括TST 阳性的结核病密切接触者、淋巴结核患者、痰菌阴性的肺结核患者和痰菌阳性的肺结核患者均呈阳性反应。

Lalvani［6-7］研究结果也证实了 ESAT-6 ELISPOT 诊断活动性结核病比 PPD ELISPOT 和 TST 的敏感性和特异性均高，且对CPTB、弥散性结核、肺外结核以及伴有 HIV 阳性的结核病均有很好的诊断效果ESAT-6 蛋白的分布特异性和良好免疫原性决定其可能作为特异性抗原用于结核病诊断本研究通过 Internet 检索到 GeneBank 发表的结核分支杆菌 ESAT-6 序列，应用PCR 方法扩增出一个 288bp 的基因片段，同时在 PCR 引物设计时，分别在上、下游引物中的 5’端加入了两个酶切位点来保证定向克隆；将 PCR 产物重组于克隆载体 pGEM-T这一过程既能保证在 DNA 测序时的准确性，也能保证在进一步的亚克隆到表达载体前提高双酶切的效率，同时还可长期保存和反复利用目的基因经 NCBI/BLAST 分析，本研究克隆基因与 GeneBank 报道基因序列有 99%同源性，预测为 95 个氨基酸组成的 ESAT-6 肽链该基因片段的获得为下一步蛋白表达、纯化及血清学诊断价值的研究工作奠定基础参考文献】［1］Katoch VM. Newerdiagnostic techniques for tuberculosis［J］. Indian J Med Res, 62004, 120 (4): 418-428.［2］AL Sorensen, S Nagai, G Houen, et al. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis ［J］.Infect Immun,1995, 63: 1710-1717.［3］Brondt L, Oettinger T, Holm A, et al. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis ［J］. J Immunol, 1996, 157: 3527-3533.［4］Martin JE, Oettinger T, Andersen P. Delayed-Type Hypersensitivity Responses to ESAT-6 and MPT64 from Mycobacterium tuberculosis in the Guinea Pig ［J］. Infect Immun, 1998, 66: 3454-3456.［5］Pathan AA, Wilkinson KA, Klenerman P, et al. Direct Ex Vivo Analysis of Antigen-Specific IFN-Secreting CD4 T Cells in Mycobacterium tuberculosis-Infected Individuals: Associations with Clinical Disease State and Effect of Treatment［J］. J Immunol, 2001, 167。