莽草酸对子囊霉素生物合成的影响.doc

1莽草酸对子囊霉素生物合成的影响作者：穆云龙 余旭亚 孟庆雄 王洪钟【摘要】 研究了添加莽草酸前体物质对子囊霉素生物合成的影响结果表明，发酵培养 24h 时添加 0.15%的莽草酸，至 96h 发酵结束时子囊霉素发酵效价最高，可达 131.7mg/L；与不添加前体物质相比，子囊霉素发酵效价提高了 51% 【关键词】 子囊霉素； 生物合成； 莽草酸； 前体子囊霉素(ascomycin)又叫 FR900520，FK520，为 23 碳的大环内酯类化合物，是免疫抑制剂 FK506(他克莫司，tacrolimus)的乙基类似物，40 多年前从含有吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的土壤中分离得到以往只知道它具有抗真菌和抗生素活性，直到发现了类似物他克莫司才进一步推动了对子囊霉素性质和生物活性的认识现在研究发现子囊霉素具有很强的免疫抑制剂作用，可用于治疗自身免疫疾病和皮肤疾病，在预防器官移植排斥方面也很有效虽然子囊霉素在免疫抑制剂方面的应用显示了良好的前景，但限制它使用的一个主要原因是产率低，成本过高，因此提高子囊霉素的发酵水平，以降低生产成本具有重要的意义。

不同大环内酯类抗生素的生物合成大都是在起始单位上添加 C2、C3、C4 延伸单位，以及 β碳原子的变化Wallace 等［1］和 Wilson 等［2］研究发现莽草酸在生物体内经脱水、加氢、电子重排等反应生成 3，4二羟基环己烷羧酸(dihydroxycyclohexanecarboxylic acid，DHCHC)，而后者正是子囊霉素生物合成的起始单位［3］在聚酮合成酶的催化下，可以通过添加作为延伸单元的短链脂肪酸合成子囊霉素［4］根据这一原理，本文选择莽草酸进行前体添加实验，期望通过2前体的添加提高生物合成子囊霉素的产量1 材料与方法1.1 菌种来源 Streptomyces hygroscopicus M721，本实验室保存1.2 培养基［5］斜面培养基(%) 葡萄糖 1，牛肉膏 0.4，蛋白胨 0.4，酵母膏 0.1，NaCl 0.25，琼脂2，pH7.0种子培养基(%) 淀粉 2.5，葡萄糖 2，黄豆粉 1.5，蛋白胨 0.5，酵母粉 0.5，硝酸钾0.25，NaCl 0.2，碳酸钙 0.2，pH7.0发酵培养基(%) 淀粉 3.5，黄豆粉 3，甘油 1，豆蛋白胨 1，磷酸二氢钾 0.08，碳酸钙 0.4，pH7.0。

1.3 培养条件［6，7］斜面培养 28℃，培养 10～15d种子培养 28℃，新鲜斜面挖块接入种子瓶，装液 40m1/250m1，摇床转速220r/min，培养 40～60h摇瓶发酵培养 28℃，10%种子液接种入发酵瓶中，装液 100m1/500m1，摇床转速 220r/min，培养 96h分离平板培养 与斜面培养条件相同，培养时间依菌落生长情况而定1.4 检测方法按文献方法使用 HPLC 法测定发酵液中子囊霉素含量3HPLC 条件 色谱柱： Diamonsil C18 column，250mm×4.6mm；流动相：甲醇∶水=70∶30；流速 1.0ml/min 检测条件 可见紫外分光光度计，205nm；进样量 20μl分析方法 将乙酸乙酯萃取的上清液浓缩过滤得样品滤液，用微量进样器准确吸取 20μl 样品滤液注入色谱仪，根据积分面积，对照标准曲线，计算发酵效价2 结果与分析2.1 莽草酸对子囊霉素生物合成的影响大环内酯类抗生素的生物合成一般是在起始单位上添加乙酸盐或丙酸盐作为延伸单元，子囊霉素中的二羟基环己烷羧酸部分是其生物合成的起始单位，而二羟基环己烷羧酸是由莽草酸经脱水、加氢、电子重排等反应形成的。

根据这一原理，本实验在发酵培养基中添加 0.05%的莽草酸前体，以不加前体的普通发酵培养基为对照，发酵 96h 后测定发酵液中子囊霉素的含量结果显示添加 0.05%的莽草酸前体可提高子囊霉素产量，达到 100mg/L，比不加前体提高 15%根据这一结果，在下面的实验中进行莽草酸加量及加入时间的优化实验 2.2 莽草酸浓度的选择确定莽草酸前体对子囊霉素的发酵有较显著的提高作用后，分别向发酵培养基中添加 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和 0.5%的莽草酸，发酵 96h 后取样测定子囊霉素产量结果当发酵培养基中莽草酸含量由 0 增加到 0.15%时，子囊霉素产量持续上升；但当莽草酸浓度超过 0.15%时，子囊霉素的产量明显降低这可能是由于莽草酸浓度过高，引起培养基 pH 的变化，抑制菌丝生长，影响子囊霉素合成；也可能是4由于高浓度的莽草酸对子囊霉素的合成有抑制作用，导致子囊霉素产量降低因此，确定前体莽草酸的加量为 0.15%，此时子囊霉素的产量为 118.6mg/L，较对照组提高了 36%2.3 莽草酸添加时间的选择在摇瓶发酵培养的 0、24、36、48 和 60h 时向发酵培养基中加入 0.15%的莽草酸前体，发酵 96h 后测定子囊霉素产量。

结果 24h 加入莽草酸前体子囊霉素产量提高最大，其子囊霉素产量高达131.7mg/L，高于 0h 加入莽草酸的产量(118.6mg/L)，与不加前体时的产量(87.2mg/L)相比提高了 51%其原因可能因为 0h 加入的莽草酸部分合成芳香族氨基酸而被消耗掉，而 24h 加入的莽草酸大部分作为次级代谢的前体直接转化二羟基环己烷羧酸而参与子囊霉素的生物合成而 36h 后添加莽草酸前体则产量明显降低，可能因为此时加入的莽草酸大部分还未来得及转化，发酵已经结束，莽草酸利用不充分3 讨论Wallace 等［1］和 Wilson 等［2］研究阐述了子囊霉素的生物合成途径限制性前体是指影响次级代谢产物合成途经中关键中间体合成的前体化合物，添加适量的限制性前体可以促进中间体的合成，最终促进产物的合成［8］大环内酯类抗生索的生物合成与饱和长链脂肪酸的生物合成相似，主要是通过聚酮途径在起始单位上延伸子囊霉素的生物合成首先是合成莽草酸然后再通过脱水、加氢等反应形成二羟基环己烷羧酸，然后在其上通过聚酮途径添加乙酸、丙酸延伸［1，2，9］因此在发酵培养基中加入适量的前体莽草酸，通过代谢调控，就有可能缩短其生物5合成周期，提高子囊霉素产量。

本实验研究表明，利用吸水链霉菌生产子囊霉素，发酵培养 24h 时在发酵培养基中添加 0.15%的莽草酸，至 96h 发酵结束时子囊霉素产量最高，可达到 131.7mg/L，与不添加前体物质的发酵培养相比，子囊霉素产量提高了 51%在本研究中，莽草酸的加入能明显地促进子囊霉素的生物合成，这与莽草酸作为含氮大环内酯类抗生素合成的起始单位作用一致［3］参考文献】［1］ Wallace K K, Reynolds K A. Biosynthetic studies of ascomycin (FK520): Formation of the (1R,3R,4R)3,4dihydroxycyclohexanecarboxylic acidderived moiety ［J］. J Am Chem Soc,1994,116(25):11600～11601.［2］ Wilson D J, Patton S, Florova G, et al. The shikimic acid pathway and polyketide biosynthesis ［J］. J Ind Microbiol Biotechnol,1998,20(5):299～303.［3］ 孙丽娟，黄捷. 含氮大环内酯类免疫抑制剂的生物合成［J］. 海峡药学，2007，19(6)：11～15.［4］ Wu K, Chung L L, Revill W P, et al. The FK520 gene cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) contains genes for biosynthesis of unusual polyketide extender units ［J］. Gene,2000,251:81～90.［5］ Morisaki M, Arai T. Identity of immunosuppressant FR900520 with ascomycin ［J］. J Antibiot,1992,45(1):126～128.［6］ Kumar P, Shorma S K, Malriya H K, et al. An improved fermentation prosess for preparing ascomycin. WO,2007029082 ［P］. 20070315.［7］ Masakuni O, Tanak H, et al. Method for inhibiting lymphokine production. US,6201005B1 ［P］.20010313［8］ 张育杰，胡海峰，朱宝泉. 前体对洛伐他汀生物合成的影响［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(9):529～531.。