细菌16S扩增详细步骤和注意要点.doc

16S 全长通用引物：8FAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG1492RGGT TAC CTT GTT ACG ACT T或sgFAGA GTT TGA TCA TGG CTC AGsgRTAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T8F/1492R使用最普遍，效果的确不错；但我们的经验是sgF/sgR （上海生工公司扩16S推荐 的引物）效果更好这2对引物对应的PCR产物都在1.5kb左右16S V6区通用引物:V6-967FCAACGCGAAGAACCTTACCV6-1046RCGACAGCCATGCANCACCT这对引物也是我们用过的，效果很好对应的PCR产物约90bp（V6区平均长度80-100bp, 一说 79bp）引物到后，先在迷你离心机上短暂离心，将黏附在管口、管壁、管盖的核苷酸粉末甩到管底， 然后在超净台操作（因为 16S 序列所有细菌里都有，扩增时很容易混入杂菌，因此本实验 涉及的每一种试剂、耗材都要非常小心，保证无污染）:按照引物合成单的说明，加入灭菌 的TE缓冲液，如果没有，灭菌的双蒸水也行（注意每OD加入量不等于最终加入量，一般 引物合成是20D）。

溶解核苷酸粉末后，用枪头吹吸混匀取5p L溶液转移到另一个灭菌 的EP管，加入45p L灭菌的双蒸水，即稀释10倍，此时引物浓度为10p M,也就是工作 浓度最好分装保存，避免多次使用导致反复冻融，造成引物不稳定以genomic DNA为模板，最适模板量为0.1-10 ng,多了可能引发非特异性扩增，少了可能 扩不出来，所以要先稀释PCR体系建议25p L,效果远好于50p L推荐用TAKARA的 LA Taq（保真度是普通Taq的6.5倍，扩增效率也较高）或FINNZYMES的Phusion （保真 度是普通Taq的50倍，pfu的6倍），以保证16S测序结果可信PCR 体系:模板 1p L引物F 0.5p L引物R 0.5p LdNTP(10 mM) 0.5p LLA Taq( 5U/p L) 0.5p L10XPCR buffer 2.5p L灭菌水 19.5p L总体积 25p L模板 1p L弓 I物 F 0.5p L弓 I物 R 0.5p LPhusion 12.5p L灭菌水 10.5p L总体积 25p L注意：1、PCR加样过程要在超净台进行操作前先开紫外灯30 min,关闭后再开风机10 min, 再用酒精棉球清洁台面和双手，方可开始操作。

2、 一定要做阴性对照（不加模板,其余成分都加）！3、 所用PCR管、枪头、水均须严格灭菌4、 加样过程中,每一管管盖开的时间不要太久,加完立刻扣上盖子,再加下一管,避免交 叉污染（genomic DNA浓度通常很高，在空气中容易逸散）5、 加样在冰盒上操作,加完轻轻吹吸,短暂离心,保证各组分均匀混合PCR 程序：针对全长：94 °C4 min94 °C30 s65C40 s72C90 s72C10 min4C0030针对 V6 区：94C4 min94C30 s55C30 s72C10 s72C5 min4C0注意：Phusion的扩增效率较LA Taq低，所以如果Phusion扩不出，可适当增加3-5个循环 数电泳检测：配制1%（16S全长）或3% （V6区）琼脂糖凝胶——样品PCR产物和阴性对照PCR产物 各取 4p L,混合 0.5p L 6Xloading buffer 点样，并点 DL2000 Marker（ 16S 全长）或 50 bp ladder Marker （V6区）——1X TAE，115V，电泳45-60min——EB染色15 min——紫外凝胶成像 仪拍摄电泳照片正确的结果应该是：1.5kb单一亮带（16S全长）或稍小于100bp （V6区）单一亮带，阴性 对照无条带。