葡萄糖苷酶催化合成红景天苷ppt课件.ppt

β-葡萄糖苷葡萄糖苷酶催化合成催化合成红景天苷景天苷1、研讨背景、研讨背景2、论文创新点、论文创新点3、结果与讨论、结果与讨论4、主要结论与建议、主要结论与建议1、研讨背景、研讨背景v 红景天苷是中药红景天中的主要有效成分，在抗缺氧、抗疲劳、抗心肌缺血、提高机体免疫力等方面具有显著效果目前红景天苷来源有植物来源、化学法合成和酶法合成〔图1〕三种2019年，Tong等利用苹果籽粉β-葡萄糖苷酶以酪醇和葡萄糖为底物初次进展了合成，反响完成后红景天苷浓度可达11.8g/L；以后，Yu 在叔丁醇体系中实现了1.9 g/L/d的时空产率；王梦亮在缓冲溶液-叔丁醇体系中反响50 h后产物浓度到达6.0 g/L；刘璘等人在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中产物浓度到达了12.4 g/L 图1 酶催化糖基化合成红景天苷 2、论文创新点、论文创新点v〔1〕对来源于苦杏仁中的β-葡萄糖苷酶在含离子液体体系中的酶学性质进展相关研讨，有关研讨未见报道v〔2〕对在离子液体-有机溶剂混合反响介质中β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研讨尚未见相关报道 3、结果与讨论、结果与讨论1、含离子液体介质中酶学性质研讨2、离子液体-有机溶剂-缓冲溶液体系中酶法催化 合成红景天苷3.1 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v 酶在不同反响介质中的活力往往具有显著差别。

经过调理离子液体的阴阳离子组成、极性和浓度等可以改动酶的活力v 目前，对糖苷酶在离子液体中酶学性质的研讨尚处于起步阶段v 研讨含离子液体反响介质中β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯基-β-D葡萄糖苷〔pNPG〕的反响特性，以期为酶催化合成糖苷的研讨提供实际指点 3.1.1 缓冲溶液体系中的酶学性质缓冲溶液体系中的酶学性质v缓冲溶液pH和反响温度的影响图2 缓冲溶液pH值对β-葡萄糖苷酶活力的影响 图3 缓冲溶液中温度对β-葡萄糖苷酶活力的影响6.050℃3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v离子液体种类和含量对酶活力的影响图4 离子液体种类及含量对β-葡萄糖苷酶活力的影响3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v不同含量离子液体中反响温度对酶活力的影响图5 不同含量离子液体中温度对β-葡萄糖苷酶活力的影响50℃3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v含离子液体介质中pH对酶活力的影响图6 离子液体-缓冲溶液中pH值对β-葡萄糖苷酶酶活力的影响6.03.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v离子液体对酶热稳定性的影响图7 离子液体-缓冲溶液中β-葡萄糖苷酶的热稳定性3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v动力学参数测定图 8β-葡萄糖苷酶在缓冲溶液和60%C2MIm·BF4中的酶促动力学曲线经过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在纯缓冲溶液中的Vmax为25.1umol·min-1·mg-1 ，Km为3.55mmol·L-1；而在含离子液体的反响体系中Vmax为3.55umol·min-1·mg-1，Km值为5.52mmol·L-1。

3.1.2 含离子液体介质中的酶学性质含离子液体介质中的酶学性质v由以上数据可得，在含离子液体的反响介质中酶催化水解pNPG的Km值变大，这能够是由于离子液体的参与加强了酶分子活性中心的刚性构造，致使酶与底物的“诱导契合〞效应减弱，进而增大了反响所需求的底物浓度，导致在含离子液体反响介质中的Km值变大，Vmax值变小3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v 〔图1〕显示，在传统水相中合成红景天苷因受水解-糖基化反响热力学平衡的限制而导致糖苷产物浓度较低以传统非水有机溶剂为反响介质是近几年酶催化生物合成的研讨热点，但非水有机溶剂中存在以下困难：〔1〕β-葡萄糖苷酶、底物、产物均易溶于水，难溶于有机溶剂；〔2〕在极性有机溶剂中，酶的溶解性、活性和稳定性差；〔3〕高浓度葡萄糖对酶具有抑制造用，且容易生成二糖因此，选择适当的反响介质实如今同一个反响体系中协调以上困难之处，是实现高效率合成的关键 v 与传统有机溶剂及电解质相比，离子液体具有一系列的突出优点，而离子液体的可设计性使离子液体成为非常规反响介质的优秀候选者3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v离子液体种类对糖基化反响的影响图9 离子液体种类对酶催化糖基化反响的影响Note：1-control；2-C1MIm·MeSO4；3-C2MIm·BF4；4-C4MIm·BF4；5-C6MIm·BF4；6-C4MIm·PF6；7- C6MIm·PF6；3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v有机溶剂种类对糖基化反响的影响图10 有机溶剂种类对酶催化糖基化反响的影响Note：1-control；2-叔丁醇(log P=0.37，粘度：3.316mPa.s，30℃)；3-1,4-二氧六环(log P=-1.1，粘度：1.3 mPa.s，20℃)；4-二甲基亚砜(log P=-1.3，粘度：2.20 mPa.s，20℃)；5-二甲基甲酰胺(log P=-1.0，粘度：0.8 mPa.s，25℃)；6-四氢呋喃(log P=0.49，粘度：0.55 mPa.s，20℃) 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v离子液体和有机溶剂体积比图11 离子液体/1,4-二氧六环体积比对酶催化糖基化反响的影响1:43.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v缓冲溶液含量对糖基化反响的影响图12 缓冲溶液含量对酶催化糖基化反响的影响15%3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v反响温度对糖基化反响的影响图13 温度对酶催化糖基化反响的影响50℃3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v底物浓度对糖基化反响的影响图14 底物浓度对酶催化糖基化反响的影响220g/L100g/L3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v金属离子种类和浓度对糖基化反响的影响图15 金属离子种类酶催化 糖基化反响的影响 图16 Mg2+ 浓度酶催化糖基化反响的影响5mmol/L3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v传质效率对糖基化反响的影响图17 振荡速率酶催化糖基化反响的影响275rpm3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v糖基化反响动力学参数测定图18 不同反响介质中动力学参数 经过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在含15%缓冲溶液的1,4-二氧六环中的Vmax为1.50 μmol·h-1·mg-1，Km为0.31 mol·L-1，KI为1.16 mol·L-1；而在含15%缓冲溶液和含17%C4MIm·PF6 的1,4-二氧六环反响介质中Vmax为2.03μmol·h-1·mg-1，Km值为0.45 mol·L-1，KI为0.17 mol·L-1。

3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v以上景象能够与底物的去溶剂化和过渡态稳定化的能量有关由于离子液体的存在，能够导致反响介质中的水活度低于含缓冲溶液的1,4-二氧六环中的水活度，因此极性底物D-(+)-葡萄糖在后者的基态能量更低，从而引起反响的活化能垒提高，最大反响速率Vmax下降，且反响底物与酶结合才干的Km也下降，底物抑制常数KI上升，导致临界底物抑制浓度下降除此之外，该景象还能够与底物的分散性、酶构造的变化及酶的构象可塑性的变化等要素也有关系 3.2 离子液体-有机溶剂-缓冲溶液混合体系中酶法催化合成红景天苷v糖基化反响的时间进程图19 酶催化糖基化反响的时间进程120h4、主要结论v1、含离子液体反响介质中，β-葡萄糖苷酶的最适反响温度为50℃， pH值为6.0，离子液体的参与在一定程度上添加了该酶的热稳定性能；v2、经过Lineweaver-Burk作图法得到酶在纯缓冲溶液中的Vmax为25.1umol·min-1·mg-1 ，Km为3.55mmol·L-1；而在含60% 离子液体的反响体系中Vmax为3.55umol·min-1·mg-1，Km值为5.52mmol·L-1。

由此可见， 离子液体的参与对酶与底物的缔合呵斥了一定的妨碍作用，减慢了水解反响速率 4、主要结论v3、β-葡萄糖苷酶催化D-(+)-葡萄糖和对羟基苯乙醇合成红景天苷的反响介质最正确组成为离子液体C4MIm·PF6的含量为17%，柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液含量为15%，有机溶剂1，4-二氧六环含量为68%在pH值6.0、振荡速率为275rpm、底物葡萄糖和对羟基苯乙醇浓度分别为100g/L和220g/L、金属Mg2+浓度为5mmol/L条件下，反响120h后红景天苷最大浓度可到达18.9g/L；v4、经过Lineweaver-Burk作图法可计算得到酶在含15%缓冲溶液的1,4-二氧六环中的Vmax为1.50 μmol·h-1·mg-1，Km为0.31 mol·L-1，KI为1.16 mol·L-1；而在含15%缓冲溶液和含17% C4MIm·PF6的1,4-二氧六环反响介质中Vmax为2.03μmol·h-1·mg-1 ，Km值为0.45 mol·L-1 ， KI为0.17 mol·L-1 。