积雪苷柔性纳米脂质体制备和表征研究.doc

积雪苷柔性纳米脂质体制备和表征研究［摘要］积雪苷是中药积雪草的有效成分，临床主 要用于促进手术创面愈合和瘢痕修复，治疗效果明显然而 其透皮吸收差和作用时间短限制了药物的推广应用本实验 采用逆相-挤出-冻干法制备积雪苷柔性脂质体冻干制剂，测 定了其电镜结构、粒径、Zeta电位、包封率、载药量、稳定 性和药物释放特征，并采用智能透皮吸收仪测定柔性脂质体 膏体的体外透皮作用积雪苷柔性脂质体为白色球状，pH 7. 03,粒径70. 14 nm，Zeta电位-36. 5 mV，3批样品的平均 包封率为31.43%, 3批冻干样品每1 mg含积雪苷的平均值 为0. 134 mg,显示积雪苷柔性脂质体具有良好的理化性质和 药学特征，并且提高了药物的透皮性能［关键词］柔性纳米脂质体；积雪苷；制备；表征 ［摘要］积雪苷是中药积雪草的有效成分，临床主要用于 促进手术创面愈合和瘢痕修复，治疗效果明显然而其透皮 吸收差和作用时间短限制了药物的推广应用本实验采用逆 相-挤出-冻干法制备积雪苷柔性脂质体冻干制剂，测定了其 电镜结构、粒径、Zeta电位、包封率、载药量、稳定性和药 物释放特征，并采用智能透皮吸收仪测定柔性脂质体膏体的 体外透皮作用。

积雪苷柔性脂质体为白色球状，pH 7.03， 粒径70. 14 nm，Zeta电位-36. 5 mV, 3批样品的平均包到■率为31. 43%, 3批冻干样品每1 mg含积雪苷的平均值为0. 134 mg,显示积雪苷柔性脂质体具有良好的理化性质和药学特 征，并且提高了药物的透皮性能［关键词］柔性纳米脂质体；积雪苷；制备；表征 积雪苷是从伞形科植物积雪草Centella asiatica中提 取出的一种白色针状结晶，有清热解毒和促进伤口愈合作 用，临床上使用的剂型有片剂和软膏，主要用于治疗手术创 伤、烧伤、外伤、瘢痕修复等［1-3］通常情况下，活性物 相对分子质量越小，越容易透过皮肤，一旦相对分子质量大 于600,活性物就很难被皮肤吸收了柔性脂质体由卵磷脂 和其他柔性成分（如胆酸钠、丙二醇）组成，变形能力比普 通脂质体大5个数量级，可穿过自身大小1/5的小孔，转运 各种极性药物透过皮肤，具有柔韧性好、渗透性强的特点［4］制备成具有促透性能的纳米级包裹体，不仅能促进生 物活性物质的皮肤透过性能，还可以提高其稳定性，是极具 发展潜力的透皮给药系统之一本实验制备了积雪苷柔性脂 质体，测试了其理化性质、包封率、载药量、稳定性和药物 释放特征，并与其他制剂对比研究了体外透皮性能。

1材料nano ZS90激光粒度和Zeta电位分析仪（Malvern Zetasizer）；高效液相仪（Waters公司）；电子显微镜（美 国FEI公司）；EF-C5高压均质机（AVESTIN）; LL3000冷冻干燥机（Thermo）;智能透皮吸收装置（上海新诺仪器厂）； ZRS-8溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）卵磷脂（日本日油株式会社）；胆固醇（分析纯，天津 市大茂化学试剂厂）；硬脂酰胺（Sigma公司）；积雪苷（上 海医药工业研究院提供）；其他试剂均为国产分析纯或符合 药用标准2方法与结果2.1脂质体制备方法采用改良的逆相挤出冻干法制备脂质体［5］，即称取适 量的卵磷脂、胆固醇、Vit E、积雪草苷置于100 mL圆底烧 瓶中，加无水乙醇和氯仿，40 1水浴震荡致溶35 C旋转 蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜贴于烧瓶壁上，加入含有 胆酸钠、甘露醇的5 mL水合30 min加入20粒玻璃珠 震荡，将脂质体悬液分散均匀高压均质机4次后用0. 22 ym 微孔滤膜过滤所得溶液在-40 C下预冻过夜，冷冻干燥24 h制得脂质体冻干粉，于4 C保存备用2.2外观结构目测：脂质体混悬液为均匀乳白色；冻干脂质体（未加 冻干保护剂）为淡黄色海绵状松散粉末或块状；加入冻干保 护剂的为流动性良好的白色粉末。

电镜：在透射电镜下观察，制备的脂质体为小多室脂质 体；扫描电镜下，未加冻干保护剂的脂质体为白色蜡块状，加冻干保护剂的脂质体为白色球状，见图12. 3脂质体的pH、粒径和Zeta电位积雪苷柔性纳米脂质体的pH 7. 03,粒径70. 14 nm，Zeta 电位-36. 5 mV （积雪苷表面吸附缓冲液中阴离子的表现），2. 4包封率和载药量检测2. 4. 1积雪苷测定方法的建立色谱条件：Waters SYMMETRY C18 色谱柱（4. 6 mmX250 mm，5 （m）；流动相甲醇-水（58:42），流速ImL.min-l;检测波长205 nm;柱 温35 C;进样量20 （L积雪苷保留时间约为8.9 min线性关系考察：在空白脂质体PBS溶液中精密加入不同 量的积雪苷对照品溶液，使其质量浓度分别为0.5，2.5, 10.0，25.0，50.0，100.0 mg.L-lo按样品处理与测定方 法进行测定，以样品质量浓度（X）与峰面积（Y）进行回归， 得回归方程Y=158. 76X+48. 92，r 0. 999 24，表明积雪苷在 0. 5〜100. 0 mg • L-1线性关系良好2.4.2包封率和载药量的测定取未分离游离药的脂质 体和透析6 h后的接收液各1.0 mL于10 mL量瓶中，加入 0. 2 mL 10% TritonX-100，加 PBS 至刻度，采用 2. 4. 1 项下 条件测定总积雪苷量和游离积雪苷量。

按下式计算脂质体的 包封■率（encapsulation efficiency, EE）和载药量（drug loading, DL）EE=（脂质体总药物质量-游离药物质量）/脂质体总药物质量X100%，经计算，3批样品的平均包封率 为31.43%o DL=（脂质体总药物质量-游离药物质量）/脂质 体质量X 100%, 3批冻干样品每1 mg脂质体的平均载药量为0. 134 mgo2.5透析法分离游离药物透析袋处理方法：先用50%乙醇煮沸lh，再依次用50%乙醇、0.01 mol • L_1 碳酸氢钠和0.001 mol • L-1乙二胺四乙酸（EDTA）溶液洗 涤，最后用蒸馏水冲洗取处理好的透析袋分别加入空白脂 质体l.OmL和PBS，密闭检查无渗漏后，浸泡于PBS 50 mL 中，50r，min-l搅拌，透析24 h,分别取接收液于脂质最 大吸收波长230 nm处测量吸收度，分别为0. 053 6, 0.052 1， 说明透析袋可以很好地截留脂质体透析分离法：取脂质体1.0 mL,于适当大小的透析袋中， 扎紧并检查无渗漏后，置于100 mL双颈圆底烧瓶中，加入 PBS50mL作为接收液，50rmin_l搅拌，分别于0，0.25, 0.5，1，2，3，4，5，6，8 h取接收液1.0 mL，同时补充 新鲜PBSl.OmL，检测各时间所取样品的药物含量；按同法 进行游离积雪苷的透析操作，见图3。

由图可知，游离积雪苷透析5 h迗到最大释放质量浓度， 即达到透析膜内外液动态平衡，而其积雪苷脂质体透析6〜7 h出现释药质量浓度剧烈升高，即在6 h时游离积雪苷迗到 透析膜内外液动态平衡，确定透析6 h为游离成分和脂质体 透析分离时间2.6脂质体混悬液及冻干脂质体的稳定性取3批脂质体及冻干脂质体粉末，分别置于室温和4 C 条件下，于0，3 min测定其包封率，pH,粒径和Zeta电位， 并观察外观，以确定其稳定性结果见表1由结果可知，脂质体及冻干脂质体在室温和4 C条件下 稳定性良好，药物泄露率小于5. 0%2.7脂质体混悬液及脂质体膏体体外释放特性取积雪苷柔性纳米脂质体混悬液5 mL （含积雪苷约78. 2 yg）、积雪苷溶液5 mL （含积雪苷约80.0 ug）,分别置于 透析袋中；积雪苷脂质体乳膏100 mg （含积雪苷约78. 3 ug） 置于滤纸筒中测定其释放特征，接收液PBS体积50 mL， 释放温度保持37.0 C,磁力搅拌速度50 r，min-l在事 先确定的时间点吸取PBS接收液0. 5mL，并随即补充相同体 积的PBS采用前述的HPLC检测释放出的药物量每个样本 平行试验3次，结果见图4。

由体外释放试验结果可知，脂质体配方具有明显的缓释 功能，可以持续释放活性成分3种样品的释放过程符合 Hugichi方程，即样品的释放主要是一个扩散过程，该过程 释放速率主要受含量、粒径大小的影响2. 8体外透皮实验分别配制不同处方的积雪苷柔性脂质体（样品A，B）、 积雪苷一般阳性脂质体（样品C）及积雪苷溶液（样品D），并分别加入到同配方的空白膏体中，使每克膏体含积雪苷约 0. 25 mg；取用于透皮吸收的商品化猪皮，根据Franz扩散 池的口径(0.66 cm2),裁剪成适宜大小，使猪皮表面(角 质层)朝上，安装于扩散池上，各涂抹膏体1 g;接收液为 PBS,温度37 C，接收液体积2.5 mL，在规定的时间点将 所有接收液取出，同时补充新的接收液；按前面的方法检测 接收液积雪苷含量，计算积雪苷累积透皮吸收量和百分率； 最后一个时间点取样后，将猪皮正反面用蒸馏水冲洗，猪皮 浸泡于PBS 50 mL中24 h，测定浸泡液积雪苷含量，以确定 积雪苷在猪皮中的滞留量结果见图5,表2由图5可以看出，4个样品都具有一定的透皮性能，样品A的透过程度显著高于其他3个样品(P[参考文献][1] 陈瑶，秦路平，郑汉臣，等.积雪草的资源分布与生药鉴别[J].中国中药杂志，2000，25 (4)： 199.[2] 于泉林，高文远，陈海霞，等.HPLC-ELSD测定积雪草提取物中积雪草苷的含量[J].中国中药杂志，2007, 32 (6)： 503.[3] 刘志峰，赵慧男，聂绍良.积雪草苷药理作用及其机制的研究进展[J].广东医学，2009，30 (4)： 649.[4] Balasubramanian V, Onaca 0, Enea R, et al.Protein delivery: from conventional drug delivery carriers to polymeric nanoreactors[J]. Expert OpinDrug Deliv，2010, 7 (1)： 63.[5] Pupo E， Padr 6 n A， Santana E， et al.Preparation of plasmid DNA-containing liposomes using a high-pressure homogenization-extrusion technique[J]. J Control Release, 2005, 104 (2)： 379.[6] Kerwin B A. Polysorbates 20 and 80 used in theformulation of protein biotherapeutics： structure and degradation pathways[J]. J Pharm Sci， 2008, 97 (8):2924.[7] Serno T， Geidobler R， Winter G. Protein stabilization by cyclodextrins in the liquid and dried state [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2011，63 (13): 1086.[8] Ingvarsson P T , Yang M， Nielsen H M.Stabilization of liposomes during drying[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2011， 8 (3)。