酶免疫测定技术分析.ppt

酶免疫测定技术,郭先锋 山西医科大学第二医院检验科,一.免疫凝集试验 二. 免疫沉淀试验 三.免疫电泳试验 四. 放射免疫试验 五.荧光免疫试验 六. 酶免疫试验 七.化学发光免疫试验 八.固相膜免疫分析技术 九.免疫组织化学技术 十.流式细胞分析技术 十一临床免疫检验的自动化 十二生物芯片技术（免疫测定的集成化和微型化）,,临床免疫检验技术,免疫凝集试验,直接免疫凝集试验 玻片法 ？ 试管法 ？ 间接免疫凝集试验 类型 正向间接免疫凝集试验 反向间接免疫凝集试验 间接免疫凝集抑制试验 协同免疫凝集试验 常用的 间接免疫血凝试验 举例？ 颗粒免疫凝集试验 胶乳颗粒凝集试验 举例？ 明胶颗粒凝集试验 举例？ 炭颗粒凝集试验 举例？ 甲苯胺红颗粒凝集试验 举例？,直接凝集反应 玻片法：ABO血型鉴定 试管法：肥达试验,,,,,,颗粒性抗原,抗体（凝集素）,,正向间接凝集反应 如：类风湿因子的检测,,,,,,,,,,,,,可溶性抗原,载体颗粒,抗体（凝集素）,反向间接凝集反应,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗体,可溶性抗原,载体颗粒,免疫沉淀试验,液相免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验 透射免疫比浊试验 散射免疫比浊试验 凝胶内免疫沉淀试验 免疫扩散试验（单扩，双扩） 免疫电泳技术（对流免疫电泳，火箭免疫电泳，免疫区带电泳，免疫固定电泳）,液相内沉淀反应,,,,,,絮状沉淀反应,环状沉淀反应 如法医学血迹鉴定,,,,,,,,,,+,+,—,—,抗血清,抗原,抗原,抗体,,凝胶内沉淀反应,,,,,,,,,,,,,,,,,,免疫扩散技术,免疫电泳技术,单向扩散试验,双向扩散试验,火箭电泳,对流电泳,免疫电泳,标记免疫技术,标记免疫技术： 将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（常用标记物：放射性核素、荧光物质、酶、化学发光剂、胶体金等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，这种免疫技术称标记免疫技术,标记免疫技术的分类,一、按测定用途分类： 1、免疫组化技术 2、免疫测定技术 二、按标记物分类： 1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、发光免疫技术 5、金免疫技术,主要的免疫标记物,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,,,,放射免疫技术,酶免疫技术,,发光免疫技术,三大经典标记技术,,酶免疫试验 概述： 1. 将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。

2.分类：酶免疫组化技术 酶免疫测定技术 均相法 异相法 固相酶免疫试验 液相酶免疫试验 均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法 异相法 需分离复合物与游离标记物后测定 临床上最常用的固相酶免疫试验是ELISA和免疫印迹,,,,酶联免疫吸附试验(ELISA),ELISA的原理和类型 一、基本要求： 1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体 （ ？）表面，并保持免疫活性 免疫吸附剂 2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性 酶结合物 3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有色反应 底物,,,,,二、必备试剂： 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 酶标记的Ab或Ag----结合物 酶反应的底物-------底物 三、方法类型： 夹心法（双抗体或双抗原） 间接法 检测抗体 竞争法 测抗体或抗原 捕获法测IgM抗体,3.竞争法 Ag ※ Ag※Ab + Ab Ag(标本) (定量) AgAb,,,,,,,,,,E,,,,,,E,,,,,,,,,,,,,,终止液,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,标本,酶标抗体,底物,,显色,显色,固相,固相,标本,酶标二抗,底物,,,1.夹心法,2.间接法,4 捕获包被法测抗体 IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。

间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上因此如 用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰在临床检验中测定抗 体IgM时多采用捕获包被法先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非 特异性的IgM）然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合继而加酶标记针对抗原的特异性抗体再与底物作用，呈色即与标 本中的IgM成正相关此法常用于病毒性感染的早期诊断特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象因此该体系常被称为酶放大体系ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量 例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml 特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。

抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性ELISA的技术要点 一、试剂制备 ㈠ 免疫吸附剂 ㈡ 酶标记抗原或抗体 二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择 三、操作标准化,,一、试剂制备： ㈠ 免疫吸附剂 固相载体 ⑴ 要求： ① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应 ④ 孔间性能一致或十分接近 ⑵ 载体性能检查 ① 载体材料：+、- 结果差别大 ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板 2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)制备： ⑴ 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液、包被方法 ⑵ 封闭：包被后再用1~5%小牛血清白蛋白再包被，以消除由于血清标本和酶结合物中的蛋白质部分地被吸附于固相载体表面而导致的非特异吸附的干扰㈡ 酶结合物： 1. 酶的要求：①酶的活性要强，纯度高、催化转化率高。

②专一性强③性质稳定、来源丰富、标记后稳定 ④判断和测量酶活性的方法简单易行、敏感、精确⑤酶本身、辅助因子和底物对人无害⑥酶的底物易于配制、保存⑦酶及其底物应价廉易得 2. ELISA常用酶：HRP（辣根过氧化物酶） 、ALP（碱性磷酸酯酶） 、ß-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物： HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm) 四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm),,ALP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 ß-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光 4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法,二、反应条件的选择 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标二抗，取OD=0.8者 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 温度、时间等 三、操作标准化 1 加样 2 保温 3 洗涤 4 比色,四、影响ELISA测定的因素： 试剂盒原材料因素 标本因素（内源性 ？、外源性 ？） 实验室环境因素 ？ 实验操作因素,试剂盒因素： A 固相材料：孔间不均 B 抗原或抗体：纯化(天然但干扰多)、合成(多肽分子较小，常有空间位阻)和基因抗原(与片段的选择和制备水平有关) C 酶结合物 D 色原底物：OPD:致Ca，不稳定(避光) TMB：水溶性差(商品：配好) E 运输储存,操作中的注意事项： 1 标本的收集和保存 试剂的准备 加样 温育 洗板 显色 比色 结果判断,样品的收集和保存： 1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用 于HRP的辅基)。

2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-” (破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白) 3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-” 4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本 底增 加 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”试剂的准备： 注意不同地区冬、夏温差，可造成达到37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大影响加样： 总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白,温育： 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 43℃20min可造成弱“+”假“-” 2 水浴较温箱等空气浴均匀,洗板： 手洗效果最佳 自动洗板要注意残留液量显色 对HRP，显色完全需30min, 15min只达80%,易造成弱“+”假“-”,比色： 单波长比色需设空白孔： OD=OD样品-OD空白 双波长比色不需设空白： OD=OD450nm-OD630nm,结果判断： 1 注意夹心法假“-” 2 用cut-off(CO)值判断 3 “灰区”时建议动态观察 4 结合临床用药：例如抑制剂对HBsAg,ELISA出现的问题和解决办法,结果重复性差： 1.加样时间的长短,保温时间不一致; 2.洗涤条件不一致; 3.操作人员的变换; 实验条件要一致. 操作要标准化和一致性.,ELISA出现的问题和解决办法,假阳性增多:（花板） 1.水箱温度偏高,酶反应时间延长; 2.洗涤不充分; 3.样品溶血; 4.检测样品放置时间过长,样品污染; 5.标本中存在干扰物质.如RF. 按说明书要求操作，注意样品的质量。

ELISA出现的问题和解决办法,全部显深色：（均板） 底物试剂污染（检查未用之底物色泽） 洗涤不充分（延长洗涤时间，增加洗涤次数） 酶结合物浓度过高 阳性对照不显色或颜色变浅： 1.试剂加样错误(检查操作过程重复试验) 2.检测波长不正确(以450nm滤光片检测） 3.加样误差较大(用精确加样器仔细加样),ELISA出现的问题和解决办法,ELISA出现“一片白”的原因：（白板） ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错或误加终止液 ⑶稀释液当作包被液使用 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降，试剂失效 ⑺样品含有NaN3ELISA出现的问题和解决办法,孔间差大(双孔对照时) 1.加样器误差较大(误差值5%): 校准加样器，或更换加样器 2.洗涤不均匀或留有气泡: 洗涤时应将气泡用洗耳球吹去 3.试剂未混匀: 混匀 4.酶标仪质量问题或预热不够: 选用高质量的仪器,预热充分,按仪器操作 手册操作.,ELISA出现的问题和解决办法,5.试剂盒未平衡至室温:(平衡至室温) 6.温育温度不平衡: 温育温度平衡,严格按 标准化操作条件进行. 阴性对照显色过深: 1.试剂污染 ; 更换试剂 2.洗涤不充分: 延长洗涤时间,增加洗涤次数 3.对照交叉污染: 重复进行试验,2019/6/14,临床常用免疫学检查,45。