绿原酸包埋工艺优化及其包埋物肠胃缓释性.docx

    绿原酸包埋工艺优化及其包埋物肠胃缓释性    刘沙彦　彭曙光　罗井清　周志成　王征Reference：为提高绿原酸的生物利用度，采用多孔淀粉对绿原酸进行包埋，再用卵磷脂对绿原酸-多孔淀粉包埋物进行包裹，形成复合包埋物通过单因素和正交试验对其吸附绿原酸的条件进行优化，得到最佳包埋条件：芯壁比为 1 ∶ 10，pH值为3，温度为30 ℃，时间为2.0 h，包埋效率达到82.5%，包埋量为82.4 mg/g通过搅拌将卵磷脂和绿原酸-多孔淀粉包埋物混合形成卵磷脂复合包埋物，其包埋效率仍为82.5%分别利用傅里叶红外、扫描电镜和紫外扫描对包埋物进行了分析和确证将2种包埋物分别于人工模拟胃液和肠液环境中进行绿原酸释放研究，结果显示卵磷脂复合包埋物在人工模拟胃液中的最高释放率为16.3%，在人工模拟肠液中的最高释放率为59.2%，而绿原酸-多孔淀粉包埋物在上述2种环境下的释放率分别为64.3%和35.2%表明卵磷脂复合物能更好地经受胃液环境，到达肠液中释放绿原酸，也表明该包埋工艺可以提高绿原酸的生物利用度Keys：绿原酸;包埋;多孔淀粉;卵磷脂;缓释性S188  ： A  ：1002-1302（2019）04-0171-05绿原酸（chlorogenic acid）是一种植物体在有氧呼吸过程中合成的苯丙素类物质，是由咖啡酸和奎尼酸缩合而成的，绿原酸的分布广泛，在食物和中药材中，如杜仲、金银花和咖啡豆等均含有绿原酸。

绿原酸具有多种功效，其中包括抗菌消炎、抗病毒、清除自由基、降糖、降脂和保肝利胆等[1-2]彭冰洁等研究发现，用绿原酸饲喂SD大鼠，能够显著减缓高脂饲喂的SD鼠质量的增加，并通过调节PI3K/Akt途径、AMPK途径和胰岛素敏感性，改善骨骼肌中糖代谢[3]此外，高纯度的绿原酸也被广泛应用于保健产品、片剂、胶囊药品和中药注射药品等但由于绿原酸本身性质不够稳定，在阳光照射、高温、潮湿、强酸碱等条件下极易发生氧化反应从而失去活性[4]，这使得绿原酸的生物利用度受到了限制因此，实现绿原酸包埋后的可控释放是提高绿原酸生物利用度的有效途径之一多孔淀粉（porous starch），又名微孔淀粉，是一种新型变性淀粉，是指具有生淀粉酶活力的酶，在低于淀粉糊化温度下作用于生淀粉后形成的产物[5]多孔淀粉在本质上仍是淀粉，应与原淀粉有类似的性能，但与之相比，最明显的区别在于多孔淀粉具有十分强大的吸附能力，多孔淀粉具有一种特殊的中空的空间结构，有大量的糖环羟基存在于这些结构表面，这些羟基是氢原子供体，可以与绿原酸上氧原子形成牢固的氢键，绿原酸上的氢原子具有酸性，电子云密度低，所以也是氢供体，而糖环分子的桥头氧原子，电负性较低，电子云密度高，可以与绿原酸中的氢原子形成牢固的氢键，如此便形成了一个稳定的六元环效应，从而使得多孔淀粉对绿原酸有良好的吸附作用[6]。

卵磷脂（lecithin）是人体组织中含量最高的磷脂，是构成神经组织的重要成分，属于高级神经营养素[7]，又称为蛋黄素，被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，因其无毒无害，且具有良好的附着性而被广泛应用于食品以及医药研究领域[8]卢晓霆等曾利用多孔淀粉、海藻酸钠和壳聚糖制备绿原酸微胶囊，在一定程度上提高了稳定性[9]本试验拟用多孔淀粉对绿原酸进行包埋吸附，最后再用卵磷脂对绿原酸-多孔淀粉包埋物进行进一步的包裹，形成性质更加稳定的绿原酸-多孔淀粉-卵磷脂复合包埋物，得到的包埋物包埋率较高且制备工艺较简单实用，可为有效应用绿原酸提供参考依据1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 材料 绿原酸普通品（纯度98%），购自源叶生物有限公司（上海）;多孔淀粉，购自龙咏生物科技有限公司（长沙）;磷酸二氢钾，购自西陇化工股份有限公司;胃蛋白酶（10 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（250 NFU/mg），购自合肥博美生物科技有限责任公司;其他试剂如卵磷脂、盐酸和氢氧化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司1.1.2 人工模拟胃肠液的配制[10] 人工模拟胃液：取9 mL浓HCl，加水约800 mL及胃蛋白酶10 g，充分溶解后，調节pH值至1.3，定容至1 000 mL，即为人工模拟胃液。

人工模拟肠液：称取6.8 g KH2PO4溶于约500 mL水中，另称取10 g胰蛋白酶加水溶解，定容至1 000 mL，用NaOH调pH值至7.6，即为人工模拟肠液1.2 仪器ZWM-uT1-10型超纯水机，湖南中沃水务环保科技有限公司;PL303型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司（上海）;DTJ-2磁力搅拌器，鼎泰恒盛生化科技设备制造有限公司;SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵，邦西仪器科技有限公司（上海）;Lab-1A-50E型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;UV1802G型紫外分光光度计，天津冠泽科技有限公司;1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司（美国）;S-3700扫描电子显微镜（日本日立公司）;VECTOR-22型傅里叶红外光谱仪（德国布鲁克公司）1.3 试验方法1.3.1 标准曲线的制作 精确称取10 mg绿原酸标准品，用超纯水定容至100 mL容量瓶中，即制成100 μg/mL绿原酸标液分别吸取原液33.3、20.0、16.7、10.0、8.3、6.7 mL定容至100 mL，配制成以下浓度的绿原酸标准液：3、5、6、10、12、15 μg/mL，空白为超纯水。

利用紫外-可见分光光度计在327 nm波长处测定绿原酸浓度和对应的吸光度[11]精确称取20 mg绿原酸标准品，在超声条件下溶解于95%甲醇中，定容至50 mL，制成浓度为400 μg/mL的绿原酸标液分别吸取原液0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 mL定容至 10 mL，配制成以下浓度的绿原酸标准液：20、60、100、140、200 μg/mL，经0.45 μm滤膜过滤后进行高效液相色谱法（HPLC）检测1.3.2 包埋物的制备1.3.2.1 多孔淀粉-绿原酸包埋物的制备 精确称取定量的绿原酸溶于一定pH值的缓冲液中，超声波控温处理作用于绿原酸15 min后，加入不同质量的多孔淀粉，设置不同温度、时间，在电磁搅拌器上匀速搅拌下作用一段时间;搅拌反应后将混合液抽滤，得到过滤物，在冷冻干燥机中干燥即得到多孔淀 粉- 绿原酸包埋物的样品1.3.2.2 绿原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋物的制备 取多孔淀粉-绿原酸包埋物样品溶解于10 mL一定pH值的缓冲液中，再取250 mg卵磷脂，溶解于10 mL乙醇溶液中，超声混匀后，将其缓慢加入多孔淀粉-绿原酸溶液中，低速反应一定时间后，在50 ℃条件下用旋转蒸发仪除去乙醇溶液，将浓缩后的样品处理后冷冻干燥，即得到绿原酸-多孔淀粉-卵磷脂复合包埋物。

1.3.3 包埋效率的测定 先将冷冻干燥得到的样品取出，称质量后，将其置于烧杯中，先加乙醇溶液溶解卵磷脂，静置 15～20 min后，抽滤除去乙醇和卵磷脂，随后取多孔淀粉-绿原酸包埋物溶解到50 mL超纯水中，置于电磁搅拌机上，于高转速、高温条件（600 r/min以上，50 ℃）下反应2 h后，取样，稀释100倍左右，于紫外分光光度计下波长327 nm处检测样品吸光度，并根据标准曲线计算其绿原酸浓度，再根据公式计算出包埋效率1.3.4 单因素试验对包埋条件的优化1.3.4.1 包埋效率和包埋量的定义 包埋效率是指包埋进去的绿原酸量与总共投入的绿原酸量的比值，计算公式为：包埋效率=（包埋进去的绿原酸量/投入绿原酸总量）×100%其中，包埋量是指单位壁材中包埋进去的绿原酸量;此处包埋进去的绿原酸含量为包埋物释放出来的绿原酸量的最大值，即在高转速高温条件下释放2 h时达到的最大释放值1.3.4.2 芯壁比对包埋效率的影响 分别以芯壁比（芯材为绿原酸，壁材为多孔淀粉，芯材与壁材的质量比即为芯壁比）為1 ∶ 20、1 ∶ 10、3 ∶ 20、1 ∶ 5，1 ∶ 4，3 ∶ 10反应，pH值为4，温度为35 ℃，时间为2 h，转速为200 r/min，测定包埋效率与包埋量。

1.3.4.3 pH值对包埋效率的影响 调节反应的pH值分别为2、3、4、5、6，芯壁比为1 ∶ 10，温度为35 ℃，时间为2 h，转速为200 r/min，测定包埋效率1.3.4.4 温度对包埋效率的影响 分别调节电磁搅拌器的温度为30、35、40、45、50 ℃，使其反应，芯壁比为1 ∶ 10pH值为4，时间为2 h，转速为200 r/min，测定包埋效率1.3.4.5 时间对包埋吸附率的影响 分别调节电磁搅拌器的反应时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，使其反应，芯壁比为2 ∶ 20，pH值为4，温度为35 ℃，转速为200 r/min，测定包埋效率1.3.5 正交试验法确定最佳包埋组合条件 在单因素试验的基础上，确定了芯壁比、pH值、温度、时间都是对包埋效率有较大影响的因素，根据单因素试验结果，设计了正交试验，即以芯壁比、pH值、温度、时间为自变量，包埋反应的包埋效率为因变量，作4因素3水平的正交试验L9（34），正交试验设计见表11.3.6 包埋物结构研究1.3.6.1 扫描电镜检测 分别取适量绿原酸、多孔淀粉、绿原酸和多孔淀粉的物理混合物、绿原酸-多孔淀粉包埋物和绿原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋复合物均匀涂抹在胶带上，在真空状态下的喷金仪中喷金30 s后，这样的样品会有1层金薄膜层，然后在扫描电镜中观察样品形状。

1.3.6.2 红外光谱检测 分别取适量的绿原酸、多孔淀粉、绿原酸与多孔淀粉的物理混合物、绿原酸-多孔淀粉包埋物和绿原酸-多孔淀粉-卵磷脂包埋复合物样品，用KBr压片，扫描波数为600～4 000 cm-1，进行红外线（IR）扫描和分析1.3.7 2种包埋物体外模拟肠液和胃液环境缓释性的研究 取最优条件下制备的绿原酸-多孔淀粉包埋物和绿原酸-多孔淀粉-卵磷脂复合包埋物，分别加入一定量的模拟胃液和模拟肠液，置于摇床下，在37 ℃、150 r/min的条件下分别反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后，取定量样液稀释一定倍数后在紫外分光光度计下于327 nm处检测绿原酸的浓度（根据待测样液的澄清程度决定是否过滤）2 结果与分析2.1 4种因素对包埋效率和包埋量的影响在包埋过程中，芯材用量如果较少，包埋效率会更好，但单位壁材的包埋量会较低所以本研究中笔者用包埋量和包埋效率来判断芯壁比对包埋效果的影响，这里取两者的乘积如图1-A所示，可以很明显地发现，在两者的交点处，包埋效率和包埋量的乘积为最高值，因此选择最佳包埋芯壁比为 2 ∶ 20，后续正交试验芯壁比梯度选取3个最佳芯壁比梯度，即1 ∶ 20、1 ∶ 10、1 ∶ 5。

由图1-B可知，包埋效率先增高后降低，在pH值为4时达到最高值，后续正交试验pH值梯度选取3个最佳pH值梯度，即3、4、5由图1-C可知，随着温度升高，包埋效率先增高后降低，在35 ℃时达到最高值，因此确定包埋最佳温度为35 ℃，后续正交试验温度梯度选取3个最佳温度梯度，即30、35、40 ℃由图1-D可知，随着时间的增长，包埋效率先增高后降低，在时间为1.5 h时达到最高值，因此确定包埋最佳时间为1.5 h，后续正交试验的pH值梯度选取3个最佳时间梯度，即1.0、1.5、2.0 h2.2 正交试验法对绿原酸包埋工艺条件的优化结果由表2可知，在正交试验中，4种对绿原酸包埋率影响的因素中，其影响程度的大小为A>B>D>C，即芯壁比>pH值>时间>温度最优的组合水平为A2B1C1D3，即芯壁比为1 ∶ 10，pH值为3，温度为30 ℃，时间为2.0 h;通过验证试验得出此条件下包埋效率可达82.5%，包埋量为41.2 mg，即单位质量淀粉对绿原酸的包埋量为82.4 mg/g。