肠道病毒病毒样颗粒疫苗研究进展.docx

          肠道病毒病毒样颗粒疫苗研究进展                    摘要：肠道病毒（Enterovirus，EV）可引发多种常见传染病，目前感染后尚无针对性药物，接种疫苗是预防感染的最佳方法病毒样颗粒（Virus-like particle,VLPs）疫苗作为亚单位疫苗具有无致病性，无感染性，免疫原性强等多种优势，是目前疫苗研发的热点之一本文肠道病毒VLPs的结构、表达方式、佐剂使用、疫苗评价所需动物模型以及新型肠道病毒疫苗等方面综述了肠道病毒VLPs疫苗的研究进展关键字：肠道疫苗、病毒样颗粒、疫苗肠道病毒（Enterovirus，EV）属于单股正链小RNA病毒，整个EV家族包括脊髓灰质炎病毒（poliovirus），柯萨奇病毒（Coxsackie virus ，CV ），埃可病毒及新型肠道病毒等，这类病毒是脊髓灰质炎、手足口病、急性出血性结膜炎、病毒性心肌炎等多种疾病的病因，且针对感染无特效药物可用，因此接种疫苗是预防疾病流行与爆发最重要的手段[1]传统的灭活疫苗难以引起细胞免疫，免疫原性偏低，生产过程具有一定危险性；减毒活疫苗则面临着毒力返强，引发免疫疾病等风险[2, 3]。

随着分子生物学技术的发展，亚单位疫苗逐渐成为疫苗研究的新方向，病毒样颗粒（Virus-like particle，VLPs）作为一种病毒亚单位结构，本质为单个或多个衣壳蛋白组装成的，与源病毒结构相同的空心颗粒[4]它不含核酸，不具备感染性，却具有同源病毒一样的抗原表位与免疫原性，能在体内有效诱导免疫反应，在疫苗的研究与应用前景上具有巨大优势1 肠道病毒病毒样颗粒结构肠道病毒为正二十面体对称球形颗粒，大小约20～30 nm，外无包膜，内有一条约7.5kbp的单股正链RNA病毒衣壳由60个单元的结构蛋白组成，每个单元由VP1、VP2、VP3、VP4、共同组成，其中其中VP1、VP2、VP3暴露在衣壳外表面，VP4隐藏在衣壳内部[5]Putnak.JR等人在对脊髓灰质炎病毒的结构研究中发现，野生型PV感染的哺乳动物细胞中存在以五聚体(14s)和空衣壳(74s）为主的几种亚病毒颗粒，这两种亚病毒颗粒无病毒RNA，均包含一套完整的衣壳蛋白，具有类似于野生型病毒的免疫原性，提示可作为一种候选疫苗[5, 6]Chen等人通过对低温电子显微镜（cryo-electron microscopy ,cryo-EM）对CVA6VLPs进行观察，发现其为大小约30nm的空心颗粒。

cryo-EM密度图则可清晰观测到CVA6 VLPs具有典型的肠道病毒正二十面体结构特征，包括在5重对称轴上的一个突出的星形平台(mesa），围绕台面的一个狭窄的凹陷(canyon)，以及在3重对称轴上的一个三叶片螺旋桨状特征（propeller）；再以EV71 VLP晶体结构(PDB 4YVS)为基础建立CVA6 VLP的原子模型 ，模型与二十面体非对称单元的cryo-EM吻合良好[7]2常用表达系统与生产方式2.1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌作为原核表达系统，由于缺乏转录后加工功能，并未广泛用于病毒VLPs的制备，但研究发现大肠杆菌中可以表达一些无囊膜VLPs，这些无囊膜VLPs往往是病毒的结构蛋白，具有自我组装形成VLPs的特性[8]Chen等人利用大肠杆菌BL21（DE3）分别表达了EV71以及CVB3 VP1蛋白VLPs（ EVP1、CVP1)，产量分别为20mg/L、25mg/L该两种VLPs抗血清经血清学检测发现EVP1可诱导产生CVP1特异性IgG和sIgA，并在攻毒实验中保护乳鼠不受EV71及CVB3的感染，而CVP1虽然可以保护乳鼠不受CVB3的感染，但不可诱导产生EVP1特异性IgG和sIgA，也不可保护乳鼠不受EV71感染[9]。

2.2 酵母细胞表达系统酵母为常见的真核细胞表达载体，克服了大肠杆菌表达系统的蛋白质翻译后加工问题，同时具有产量高，成本低，操作简便等优点，适用于肠道病毒VLPs疫苗的商业开发[10]Jore等将编码蛋白酶的3CD基因与编码脊髓灰质炎病毒衣壳前体蛋白的P1基因共同转染入酵母细胞中表达，并从表达产物中收获了与真实脊髓灰质炎病毒形貌相似的颗粒[11]Zhao等人将包含3CD及P1线性化基因的载体转入毕赤酵母PichiaPink™ 中，成功构建了肠道病毒D组68型（EVD 68）VLPs的整合型重组酵母系统[12]说明酵母系统可适用于多种不同肠道病毒VLPs的生产在VLPs产量方面，Li等人采用酿酒酵母（S. cerevisiae）表达系统生产EV71 VLPs，产量约为0.25mg/L[13]Zhang等人采用毕赤酵母生产同型别VLPs，使用总可溶性蛋白(total soluble protein，TSP)百分比描述产量，结果显示大部分酵母转化株产生的EV71抗原水平均在0.5% TSP以上，最高表达量达到4.9%，通过Bradford法测定EV71VLPs蛋白浓度为150mg/L[14]。

2.3 昆虫细胞表达系统昆虫杆状病毒表达系统( insect baculovirus expression vector system，IBEVS)具有高效表达、基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、安全性高、且有完备的翻译后加工修饰系统等特点，是除酵母细胞外应用最多的VLP表达系统[15]董轲等利用IC-BEVS构建了含有 EV71 VP1 基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞TN5后成功表达了EV71的病毒样颗粒，这为研制EV71的新型疫苗奠定基础[10]Balaji等人采用Bac-To-Bac系统构建了CA16与EV71 VLPs，并探究了昆虫细胞系、培养温度、出芽病毒(budded virus ，BV)的连续传代效应等对EV71和CVA16 VLPs产量的影响研究发现：Sf-9细胞的VLPs产量比High FiveTM 细胞更大，两种VLPs的产量在适当降低培养温度后均有一定程度的增加，而BV病毒在超过连续5次的传代后会对VLPs的稳定性造成一定影响[16]Chung等则进一步优化了宿主细胞、细胞密度、培养方式和溶解氧( dissolved oxygen ，DO)等工艺参数，发现当DO = 30%，细胞密度为4x106/ml时可获得最高胞外VLPs产率，约为64.3 mg/L。

比传统使用杆状病毒感染锥形瓶中Sf-9细胞获得的产量(1.5 mg/L)增加了43倍[17]3 佐剂的选择与使用佐剂是一种可以非特异性增强免疫应答强度或改变免疫应答类型，但自身却无抗原性的制剂佐剂可以提高机体对初次免疫的反应,并使其超过保护性阈值，VLPs一类的亚单位疫苗通常需要与佐剂配合，从而增强免疫原性[15]3.1铝盐佐剂铝盐佐剂是指含有Al3+的无机盐，具有成本低廉、使用方便、毒性较小等优点[18]其可以与抗原结合形成抗原贮存库, 使抗原得以缓慢稳定地释放，目前已广泛应用于科研与临床Chong等人在兔和非人灵长类动物免疫原性研究中发现，只有使用高剂量明矾佐剂(> 100 μg)配的制EV71VLPs疫苗才能诱导病毒中和抗体反应进一步探究铝盐佐剂原理可获悉，EV71的等电点（isoelectric point，PI）为5.86，意味着EV71 VLPs在中性条件下带负电荷[15],而铝盐佐剂中氢氧化铝和磷酸铝的零电荷点分别为11和5，因此在制备EV71-VLP疫苗时选择氢氧化铝作为佐剂，可使佐剂与抗原的静电相互作用最大化[20]Yang等发现免疫时血清总抗体水平与中和抗体水平不成比例，中和抗体水平与VLPs的含量有关。

在佐剂含量一致时，当以0.08μg低剂量VLPs进行免疫时，机体可产生较多的总抗体，却无法产生足量的中和抗体，VLPs含量达到0.3ug时即可产生足量的中和抗体，此后再提高VLPs的含量，小鼠血清内中和抗体滴度不会有明显差异而在乳鼠的被动保护中，乳鼠的存活率对疫苗中VLPs的剂量有显著依赖性：当剂量低于0.312µg,存活率低于35%当剂量达到5µg时，疫苗能提供完全的被动保护，但IgG总量和中和抗体无差异，这可能与不同水平的抗体亲和力成熟有关最终该研究得出EV71-VLPs疫苗的氢氧化铝佐剂的量为一剂225μg[15]3.2 弗氏佐剂弗氏佐剂（Freund′ s adjuvant，FA）属于抗原传递系统佐剂，分为完全弗氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）和弗氏不完全佐剂（imcomplete Freund′s adjuvant，IFA），因其具有的优良效应使其广泛应用于科研[18]Gangaplara等在研究CVB3 VLPs疫苗的保护性时意外发现单独使用CFA免疫的A/J小鼠 对CVB3病毒感染引发的病毒性心肌炎有完全保护作用,提示像CFA这样的免疫系统非特异性启动佐剂可能足以预防部分病毒感染[20]。

Chung等在仅使用10 μg经CFA配制的EV71 VLPs疫苗免疫小鼠时，仍诱导小鼠体内产生滴度为512的病毒中和抗体，且这些小鼠抗血清对EV71不同基因型(C2、B4、C4, B5和C5)均有中和作用[17]4新型肠道病毒疫苗VLPs技术不仅可以生产单价疫苗，还可通过基因工程技术或者化学键偶联的方式将单个或多个抗原表位结合在具有自组装能力的VLPs载体上，构建嵌合病毒样颗粒疫苗（Chimeric Virus-like Particles，cVLPs），此方法不仅可以增强抗原的免疫原性，同时也可为多种病毒的感染提供保护[21]Lyu等人的研究证实了在EV71 VP1 BC环上插入一段外源短肽并使其暴露于病毒颗粒表面，不会导致衣壳蛋白重大的结构改变和病毒复制及蛋白组装异常,进一步研究[22]以CVA16 VP1 PEP71表位替换EV71-VLPs VP1 SP70表位，采用晶体衍射分析证实大部分EV71线性和构象表位得以完好保留，嵌入的CVA16表位也完好的展示在VLPs分子表面[23]Luo等以EV71 VLPs为载体，用4段CVA16 VP1上的保守中和表位替换了EV71结构蛋白的相应区域，构建了二价嵌合VLPs，该VLPs具有针对EV71感染的完全保护能力与针对CVA16感染的部分保护能力，且比其同型灭活病毒疫苗，显著降低了Th2型细胞因子的分泌[24]。

Pu等则是将EV71sp70表位与sp55表位嵌入乙肝病毒核心蛋白（HBcAg），成功构建了可诱导机体同时产生EV71抗体与乙肝抗体的嵌合VLPs疫苗，该疫苗在无佐剂添加的前提下仍具有较高的免疫原性与保护性[22]然而，有时基因工程制备的重组蛋白仅会在细胞内形成包涵体而不是VLPs[8]，通过化学偶联的方法可方便和多功能性地将不同的抗原偶联到VLPs然而化学共轭中，以非共价键附着在VLPs表面的抗原有时不能诱导免疫应答针对上述不足，tang等提出一个新的VLP改进策略：通过sortase A介导的转肽作用，将人巨细胞病毒的AD-4域糖蛋白B (gB)与EV71的线性表位SP70高密度地结合在乙肝病毒核心蛋白(HBc) VLPs表面的LPET基序上这种方法制备出的嵌合VLPs诱导了强烈的特异性IgG反应，且可以诱导有效的EV71抗体，与EV71病毒产生中和[25]5展望肠道病毒是包括手足口病在内多种流行传染病的主要病原，是公共健康的严重威胁目前并无针对肠道病毒感染的药物上市，因此注射疫苗是预防疾病的最好方法肠道病毒在流行期间易发生基因突变与重组，产生各种亚基因型病毒[26]复杂多变的基因型是疫苗研发的重要挑战。

与传统灭活疫苗、减毒活疫苗相比，病毒样颗粒疫苗的免疫原性及安全性都较为优良；在实际应用中，病毒样颗粒不仅可以直接作为抗原使用，亦可作为载体，通过融合、偶联多种不同的抗原表位构建多价嵌合病毒样颗。