糖蛋白与蛋白聚糖.ppt

第四章 糖蛋白与蛋白聚糖4.1. 概述糖类指多羟基醛和多羟基酮及其缩合产物， carbohydrate曾译为碳水化合物；saccharide更多地 与前缀组词，如monosacchride(单糖)、 oligosaccharide(寡糖)和polysaccharide(多糖)等； sugar除表示食糖外还用于表述糖类的组成，常有单糖 的含义；glycan则译为聚糖，是寡糖和多糖的统称 ，糖类仅仅被视为主要的能源物质、碳源和结构材料 ，对糖类的研究局限于单糖及其代谢，以及淀粉、糖 原等少数多糖虽然早就发现糖-肽共价复合物，鉴于 一些含糖的酶类去掉糖组分之后活性并无明显改变， 因而把糖组分当作杂质，千方百计加以去除1)复合糖的分类：复合糖(complex carbohydrate)可分为 聚糖 (glycam)和糖缀合物或糖复合物(glycoconjugate)其 中聚糖包括同聚糖(homoglycan)和杂聚糖(heteoglycan) ；糖缀合物则包括糖肽复合物(glycopeptede complex) 、糖脂复合物(glycolipid complex)和糖-核酸复合物 (carbohydrate-nucleic acid complex)。

糖肽复合物可 分为肽聚糖(peptideglycan)或胞壁质(murein)，是细菌 细胞壁结构材料；糖蛋白(glycoprotein)和蛋白聚糖 (proteoglycan)糖脂可分为糖鞘脂(glycosphingolipid) 、糖基酰基甘油(glycosylacylglyceride)和脂多糖 (lipopolysaccharide)2)糖蛋白和蛋白聚糖中常见的单糖组分：糖复合物中常见的单糖组分包括4种己糖：D-葡萄 糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、L- 岩藻糖(L-Fuc)；两种乙酰化己糖胺：N-乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；两种糖醛酸：D -葡萄糖醛酸(GlcA)和L-艾杜糖醛酸(IdoA)；一种戊糖 ：D-木糖(D-Xyl)以及甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸缩 合产物，它的4、7、9-位羟基和5-氨基发生取代产生一 系列产物，统称唾液酸(Sia)，其中最重要的是N-乙酰- D-神经氨酸(NeuNAc)等3) 聚糖结构的复杂性：糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分尽管由上述为数有限的 几种单糖组成，但每种单糖有吡喃式与呋喃式结构之分， 异头碳有α-与β-型之分，每个单糖有多个羟基，可能以 不同的方式形成糖苷键和分枝结构。

两种不同的氨基酸可 形成两种二肽；3种不同的氨基酸可形成6种三肽；6种不 同的氨基酸可产生176种六肽而两种相同的己糖可能形 成11种二糖；三种相同的己糖可产生176种三糖；6种不同 的己糖则能形成109种六糖，如带有分枝六糖的数目可达 1012个如果考虑到糖残基不同部位进一步修饰：磷酸化 、硫酸化、氨基化、乙酰化、糖基内部脱水成内醚等，聚 糖的 数目无疑会更大聚糖结构的复杂性增加了研究工 作的难度，同时暗示它可以蕴含更多的信息，成为生物信 息的理想载体4) 糖缀合物的许多重要的性质和 功能与其糖链特有的结构密切相关， 为了便于表现糖链的结构，我们将采用一 套流行的简化符号系统(图4.1)，标明糖链 单糖之间的连接方式及其修饰状况图4.1 推 荐的描述 糖链结构 的简化符 号与惯例以一个复杂型 分枝的双天线 N-聚糖为例 除L-Fuc和L- IdoA外，其余 糖基均为D-型 ；糖链中的单 糖都是吡喃型( 六元环)的；除 Sia的糖苷链从 C2开始，其余 糖基的糖苷链 均从C1开始4.2. 糖蛋白(glycoprotein)广义的糖蛋白泛指糖肽共价复合物为了研 究的方便，目前已将肽聚糖和蛋白聚糖划分出来 ，狭义的糖蛋白专指肽链与一个或多个聚糖链共 价结合形成的复合物，其聚糖链通常少于15个单 糖残基（少数聚糖链可能含有200～30个单糖残 基），且大多数具有分枝。

4.2.1 糖蛋白的结构 4.2.1.1 糖蛋白结构研究 糖蛋白的结构研究包括蛋白质部分的结构 测定和糖链部分的结构测定糖蛋白糖链数目糖链平均间距血清糖蛋白 51α1-酸性糖蛋白460胎球蛋白6113人触珠蛋白13209人α2-巨球蛋白31296牛甲状腺球蛋白19375人转铁蛋白2776人IgG2 胰糖蛋白： 124牛胰RNaseB1270DNase1 粘蛋白： 羊领下腺粘蛋白8006猪领下腺粘蛋白~5008胶原： 兔角膜胶原19173牛皮肤胶原8435大鼠皮肤胶原4770兔巩膜胶原31000表4-1 糖蛋白中糖链数目与间距的变动(1)聚糖链与蛋白质的分离：从糖蛋白释放完整的N-聚糖可采用专一的肽： N-糖苷酶F水解，也可用肼解裂解O-聚糖可用内切α -N-乙酰氨基半乳糖苷酶水解，或在0.05～0.1mol· L －1 NaOH_ mol·L－1 NaBH 4通过β-消去反应来完成 反应中产生的聚糖还原端被NaBH4还原成对碱稳定的糖 醇，以防糖链被碱降解如用3H标记的硼氢化钠，可对 释放的聚糖还原端进行标记，便于在分离纯化中跟踪 也可用蛋白酶降解产物进行分级分离与纯化，得 到不同的糖肽和／或聚糖链，即可用于结构分析。

1(2) 聚糖的单糖组分分析：用糖苷酶或酸／碱将上述糖肽水解，把其中的单 糖组分转变成热稳定挥发性衍生物(如糖三甲基硅醚、糖 醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等)，再用气-液相色谱法(gas- liquid chromatography,GLC)进行鉴定和定量，检测精度 可达n mol级GLC与质谱法(mass spectrometry,MS)联用 ，检测精度可达10pmol级如将单糖还原端进行荧光标记 ，再用HPLC(high-pressure liquid chromatoqraphy)与 荧光测仪对其进行鉴定和定量，检测精度可达pmol～fmol 水平1980年代HPAEC-PAC(high pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection) 用于单糖组分分析，无需制备单糖衍生物，检测精度可达 5～50 pmol水平氨基糖可用氨基酸分析仪测定；唾液酸 除用灵敏度较低的比色法测定外，已能利用高灵敏度GLC- MS对离子化的唾液酸进行测定3) 糖链结构分析：已发展了一系列技术，可对糖链中每个单糖残基的异头结构 (α或β)、环式结构类型(p或f)以及与其它糖残基连接键的位置进 行测定。

这些方法包括外切糖苷酶消化，利用特异性极高的外切糖 苷酶水解糖链，再用HPLC、HPTLC (high- performance thin- layer chromatography)和HPCE(high-performance capillary electrophoresis)成套仪器进行检测，精度达fmol～pmol级，可得 到糖基连接链位置的信息由于可用的高专一性外切糖苷酶种类有 限，这种方法的应用有很大的局限性甲基化分析法利用甲基化等 修饰反应制备糖衍生物，经GLC与质谱仪联用进行检测，精度可达 0.1～10 pmol，可鉴定和定量残基上特定位点取代以及糖的环式构 型质谱法在糖结构分析中可测定糖环上键的类型与位置，如采用 FAB(fast-atom bombardment)、LSIMS(liquid secondary ion mass spectrometry)和MS／MS(tandem mass spectrometry)，检测 精度可达fmol～pmol水平NMR(nuclear maqnetic resonance)用 于糖结构分析可测定糖基的异头构型和键的位置，精度达10pmol～ n mol水平，最显著的优点是无需制备糖衍生物。

(4) 糖链序列分析：早期曾用外切糖苷酶从糖链非还原端依次切下 特定的单糖，同样由于可用的酶种类有限，而且进 行糖链序列分析的糖苷酶纯度应当极高，因而限制 了这种方法的应用，常用的糖苷酶见表4.21980年 代之前，糖链测序主要用MS和MS-GLC法，需对样品 进行甲基化、乙酰化等预处理1980年后采用FAB- MS和ESI(electrospray ionization)-MS，检测精度 达n mol～p mol水平酶来 源专 一 性Clostridium perfringensFucα1 2Galα-L-岩藻糖苷酶βDiplococcu.s pneumoniasGalβ1 4GlcNAcβ-半乳糖苷酶Canavalia ensiformisManα1 2/6Manα-甘露糖苷酶Diplococcus pneumoniasGlcNAcβ1 glycanβ-D-N乙酰氨基葡萄糖苷酶Diplococcus pneumoniasSiaα2 3/6Gal神经氨酸酶 Siaα2 6GkNAc内切糖苷酶内切β-D-半乳糖苷酶Bacteroides fragillis-GlcNAcβ1-3Galβα1 3/4GalNAc-Flavobacterium meningoseptiumx-ManMan-GlcNAc- GlcNAcβ1Asn-x-ManD-糖苷酶Diplococcus pneumoniasGalβ1-3GalNAcα1 Ser/Thr外切糖苷酶N-糖苷酶F表4.2 用于聚糖测序的几种糖苷酶4.2.1.2 糖-肽连接键的类型糖蛋白中的聚糖链均由其还原端以接枝方式与肽链特定部 位的氨基酸侧链基团相连接，主要分为以下两大类：(1) N-连接键：D-GlcNAcβ-Asn，又称Ⅰ型糖肽键，由糖链还原端的 β-D-GlcNAc残基C1-OH基与多肽链Asn残基侧链酰胺-NH2间缩合 ，形成C-N糖苷键，广泛分布于许多糖蛋白中。

以肽链N端-NH2为 连接点形成的N-糖-肽键迄今仅见于血红蛋白Alc2) O-连接键：由糖链还原端与含羟基的氨基酸侧链-OH间形成C-O糖苷键 又可分为：①D-GalNAcα-Ser/Thr，又称为Ⅱ(i)型糖-肽键 ，分布广泛②D-Xylβ-Ser/Thr，又称Ⅱ(ii)型糖-肽键，主 要存在于一些蛋白聚糖中③D-Galβ-Hyl，又称Ⅲ型糖-肽键 ，主要存在于胶原和丝心蛋白中④D-Araβ-Hyp，仅见于高等 植物中的一些糖蛋白 β型乳糖 Gal（β1→4）Glc蔗 糖 Fru（β2→1α）Glc茧 蜜 糖Glc（α1→1α）Glc区 别N-聚糖O-GalNAc聚糖糖-肽键GlcNAcβ1-N（Asn-x-Ser/Thr）GalNAcα1-O（Ser/Thr）聚糖组成都含Man，GlcNAc,绝大多数不含GalNAc都含GalNAc,不含Man糖链分枝全部分枝不一定分枝糖-肽键化学裂解肼解稀碱水解聚糖内侧核心结构都有分枝的五糖Man3GlcNAc2有多种，除GalNAc外，可 含Gal或/和GlcNAc表4.3 N-聚糖与O-GalNAc聚糖的主要区别￿血清糖蛋白多以N-糖肽键连接，因而N-聚糖 又称为血清型(plasma type)。

血清型聚糖均由 一个共同的五糖核心和不同数量的外链组成核 心五糖结构如下：Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-AsnManα1Manα1364.2.1.3 N-聚糖的结构根据核心五糖中两个α-Man上连接的糖基，N-聚糖 可分为三类：高甘露糖型（high- or oligo- mannose type) 、 复杂型（complex type）和 杂合型（hybrid type）图4.2 三种类型的N-聚糖结构示意图￿￿ 虚线框内为核心五糖A.高甘露糖型；B.复杂型；C.杂合型◆■α2α2α2α3α3β4β■■■Asnβ2。