吸光光度法的灵敏度与准确度.ppt

8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度吸光光度法的灵敏度与准确度8.3.1 灵敏度的表示方法灵敏度的表示方法 1.摩尔吸光系数摩尔吸光系数 ( ) 2. A=   b c   =A/bc (L·mol-1·cm-1)  越大越大, 灵敏度越高灵敏度越高:   <104 为低灵敏度为低灵敏度; 104～～105 为中等灵敏度为中等灵敏度;   >105为高灵敏度为高灵敏度.1 2. Sandell(桑德尔桑德尔)灵敏度灵敏度 (S)定义：定义：截面积为截面积为1cm2的液层在一定波长或波段处，的液层在一定波长或波段处，测得吸光度为时所含物质的量测得吸光度为时所含物质的量用用S表示，单位表示，单位：：g·cm-2A=   bc= bc   S小小灵敏度高灵敏度高; ;   相同的物质相同的物质, M小则灵敏度高小则灵敏度高.变换单位变换单位:bcmcmol/L=bcM106  g/1000cm22例例1 邻二氮菲光度法测铁邻二氮菲光度法测铁 (Fe)=1.0mg/L, b=2cm , A=0.38 计算计算  、、S 和和解：解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3/55.85 =1.8×10-5(mol·L-1)S=M/  =55.85/1.1×104=0.0051 ( g g/cm2)或或3 c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4 g/100mL4例例2 比较用以下两种方法测比较用以下两种方法测Fe的灵敏度的灵敏度.B. 用用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁二苯基邻二氮菲光度法测定铁ε533＝＝2.2×104 L·mol-1·cm-1S = 55.85/(2.2×104)＝＝0.0025 (g·cm-2)B方法比方法比A方法的灵敏度高方法的灵敏度高.A. 用邻二氮菲光度法测定铁时，用邻二氮菲光度法测定铁时，ε508＝＝1.1×104 L·mol-1·cm-1S = 55.85/(1.1×104)＝＝0.0051 (g·cm-2)58.3.2 准确度准确度—仪器测量误差仪器测量误差100806040200T/%  c1  c2  c3  T  T  T-透光率读数误差透光率读数误差 c c1c1 c2c2 c3c3>< 由于由于T 与浓与浓度度c 不是线不是线性关系，故性关系，故不同浓度时不同浓度时的仪器读数的仪器读数误差误差T 引引起的测量误起的测量误差差 c/c不不同。

同6测量误差公式推导测量误差公式推导:dA = d(-lgTTT/TA= - lgTT lgT 最大时，即最大时，即(TlgT) ′= 0 时误差最小时误差最小, 算得算得 lgT= - 0.434 , T=36.8% , A 71086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测浓度测量的相量的相对误差对误差与与T(或或A)的关的关系系实际工作中，应控制实际工作中，应控制T在在10～～70％％, A在在0.15～～1.0之间之间 (调调c, b,  )88.4.1 显色剂与显色反应显色剂与显色反应 ：：：：助色团助色团－－NH，－，－OH，－，－X （孤对电子）（孤对电子）ne8.4 显色反应与分析条件的选择显色反应与分析条件的选择O生色团生色团：：－－N＝＝N－，－－，－N＝＝O，，OC=S,－－N （共轭双键）（共轭双键）πe9有机显色剂有机显色剂CH3－－C－－C－－CH3 HO－－N N－－OH ＝＝＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：型：NNNOH OHON型型：：PARNH NHNSNS型型：：双硫腙双硫腙NN型：型：丁二丁二酮肟酮肟邻二邻二氮菲氮菲磺基水杨酸磺基水杨酸10显色反应的选择显色反应的选择Ø灵敏度高灵敏度高，一般，一般ε>10 4;Ø选择性好选择性好;Ø显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收, 对照性好对照性好,   max> 60 nm;Ø反应生成的有色化合物反应生成的有色化合物组成恒定，稳定组成恒定，稳定;Ø显色条件易于控制，显色条件易于控制，重现性好重现性好.118.4.2 显色条件的确定显色条件的确定c(R)c(R)c(R)1. 显色剂用量显色剂用量（（c(M)、、pH一定）一定）Mo(SCN)32+ 浅红浅红Mo(SCN)5 橙红橙红Mo(SCN)6- 浅红浅红Fe(SCN)n3-n122. 显色反应酸度显色反应酸度（（c(M)、、 c(R)一定）一定）pH1

消除干扰，也可采取分离法Fe3+, Cu2+FeSSal（紫红）（紫红）Cu2+pH= 2.5SSal测测Fe3＋＋:(控制控制pH)182. 物理法物理法—选择适当的测定波长选择适当的测定波长515655415500钍钍-偶氮砷偶氮砷III 钴钴-亚硝基红盐亚硝基红盐 AA络合物络合物络合物络合物试剂试剂试剂试剂 /nm /nm19 1. 1. 仅络合物有吸收，仅络合物有吸收，溶剂溶剂作参比 如如 phen—Fe phen—Fe2+2+ 标准曲线标准曲线2.2.待测液也有吸收待测液也有吸收，，被测液被测液作参比 如如 测汽水中的测汽水中的 Fe Fe3. 3. 显色剂或其他试剂也有吸收，显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液空白溶液作参比作参比 例例: :邻二氮菲光度法测邻二氮菲光度法测Li2CO3中的中的 Fe，， 参比溶液为不含参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂样品的所有试剂4. 4. 干扰组分与显色剂有反应干扰组分与显色剂有反应, ,又无法掩蔽消除时：又无法掩蔽消除时： 1 1））掩蔽被测组分掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比，再加入显色剂，作参比. .2 2））加入等量干扰组分加入等量干扰组分到空白溶液中到空白溶液中, ,作参比作参比. . ----选择适当的参比溶液选择适当的参比溶液208.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用8.5.1 单一组分的测定单一组分的测定1. 金属离子金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟丁二酮肟, Co-钴试剂钴试剂2. 磷的测定磷的测定: DNA中含中含P～～9.2%, RNA中含中含P～～9.5%, 可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄( 小小)磷钼磷钼(V)蓝蓝( 大大)Sn2+213. 蛋白质蛋白质测定测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等4. 氨基酸氨基酸测定测定—茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5. 水质水质检测检测: NH4+、、NO2-、、Mn2+、、Fe2+、、SO42-、、Hg2+----6. 药物药物含量测定含量测定—比吸光系数定量；荷移比吸光系数定量；荷移光谱法测定光谱法测定.7. 紫外吸收紫外吸收(UV): NO2-、、NO3-、、SO42-、、SO32-、、CO32-、、SCN-、酪氨酸、色氨酸、、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。

苯丙氨酸、蛋白质等228.5.2 多组分的测定多组分的测定  xl l1,  yl l1,  xl l2,  yl l2由由x,y标标液液 在在 1,  2处分别测得处分别测得.a)在在 1处测组分处测组分x, 在 2处测组分处测组分y.b) 在在 1处测组分处测组分x; 在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求y.c) x,y组分不能直接测定组分不能直接测定A1= xl l1bcx+  yl l1bcy(在 1处测得处测得A1) A2 = xl l2bcx+  yl l2bcy(在 2处测得处测得A2)23 8.5.3 光度滴定光度滴定NaOH滴定滴定 对硝基酚对硝基酚 pKa=7.15 间硝基酚间硝基酚 pKa=8.39  pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚对硝基酚间硝基酚间硝基酚酸形均酸形均无色无色. .碱形均碱形均黄色黄色24典型的光度滴定曲线典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。

Vsp滴定剂吸收滴定剂吸收Vsp被滴物吸收被滴物吸收Vsp滴定剂与待滴定剂与待测物均吸收测物均吸收Vsp产物吸收产物吸收258.5.4 络合物组成的测定络合物组成的测定1. 摩尔比法摩尔比法: : 固定固定cM ,改变改变cR 1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 262. 等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法: :M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:20 0.2 0.4 0.6 0.8 10 0.2 0.4 0.6 0.8 1278.5.5 一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL H＋＋＋＋LKa＝＝[H+][L]/[HL]高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHL＝＝εHL·c(HL)；；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在，可测得AL ＝＝εL·c(HL).代入整理：代入整理：或或配制一系列配制一系列c相同相同,pH不同的溶液不同的溶液,测测A.HL、、L 颜色不同颜色不同[HL][L]28MO吸收曲线吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600 /nmA曲线曲线pH11.10, 1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80由每份溶液的一由每份溶液的一对对pH、、A，可求，可求得一个得一个Ka, 取平取平均值即可均值即可.298.6 紫外可见分光光度法在有紫外可见分光光度法在有机定性分析中的应用机定性分析中的应用8.6.1 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带有机化合物分子的电子跃迁和吸收带非键轨道非键轨道成键轨道成键轨道成键轨道成键轨道反键轨道反键轨道反键轨道反键轨道   (nm)HCHO==n   *>     *>     *>n   *>     *> n   *30跃迁跃迁  max(nm)     *~150(<200)n   *~200100～～300n   *200～～80010～～100   *~200~104190CH2－－CH2 CH2135 （（C－－C））CH3－－CH2－－CH3135 （（C－－C））CH3－－CH3125 （（C－－H））CH4λmax（（nm））饱和烃类饱和烃类  →→ * *跃迁跃迁( (饱和烃类饱和烃类) )（作溶剂）（作溶剂）31 max(nm)   max(nm) H2O1671480CH3OCH31842520CH3OH183150CH3NH2215600CH3Cl173200(CH3)2NH220100CH3Br204200(CH3)3N227900CH3I258365 n→  * 跃迁（含具跃迁（含具n电子的杂原子）电子的杂原子）32n→ * 跃迁跃迁（带孤对电子的杂原子与其他（带孤对电子的杂原子与其他 键共轭）键共轭）280～～300饱和醛酮饱和醛酮1000( n→ *)16( n→ *)186280CH3COCH3异辛烷异辛烷22280CH3－－NO2EtOH5339CH3N＝＝NCH3H2O60214CH3CONH2EtOH41204CH3COOH  max(nm））介质介质33π→π* 跃迁（不饱和烃类跃迁（不饱和烃类) )6000173CH三三CH14000175CH2＝＝CH2  max(nm））π→π* 跃迁跃迁的的 max短，短，  大大, n→ * 跃迁跃迁的的 max长，长，  小小.34电荷迁移跃迁（荷移光谱）电荷迁移跃迁（荷移光谱）特点：谱带宽特点：谱带宽, ,吸收强度大吸收强度大, ,λλmaxmax处的处的εε可大于可大于10104 4 。

Fe3＋＋—SCN- Fe2＋＋—SCN （分子内氧化还原）（分子内氧化还原）h   RN1R2Rh   D—AD＋＋—A-e e给予体给予体 e e接受体接受体e e给予体给予体e e接受体接受体N1R2-+h   CROCRO-+h   358.6.2 有机分子中的生色团与助色团有机分子中的生色团与助色团严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电子的基团，严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电子的基团，才是才是生色团生色团（（ n→π*，， π→π*））－－C－－C－，－－，－C－－H ，， σ→σ* ～～150nmn→σ*，， σ→σ*::C＝＝O C＝＝C－－O－－::n→π*，， π→π*－－C－－O－，－－，－C－－S－－n→σ* ,σ→σ* ～～200nm::::－－C－－N－，－－，－C－－Cl：：:::C＝＝C ,－－C ＝＝ C－－ π →π* ,σ→σ* ～～200nm （孤立双键（孤立双键 <200nm））生色团生色团类类 型型36不饱和基团助色效应大不饱和基团助色效应大256 261 264 282 320 276(K带带) 苯环苯环B带带λmax(nm)CH3ClCH=CH2C CH3O常见常见助色团助色团及其助色效应及其助色效应(红移红移—— max增大增大):－－F<－－CH3<－－Cl<－－Br<－－OH<－－OCH3<－－NH2<－－NHCH3< －－N(CH3)2 <－－NHC6H5<－－O－－例：例： CH3Cl CH3Br CH3I max(nm) 172 204 25840共轭烯烃键数与能量的关系共轭烯烃键数与能量的关系 E E E E 4* 5* 6* 3 2 1 3 2 1 4 5* 6* 7* 8* 3* 4* 2 1 1 2*共轭共轭 键越多，最大吸收峰波长键越多，最大吸收峰波长  越长越长.42双键数双键数物质名称物质名称 max(nm)5癸五烯癸五烯335（（浅黄浅黄））1.2×1056二甲基十二碳六烯二甲基十二碳六烯360（（黄黄））1.4 ×10582－羟基－－羟基－－胡萝卜－胡萝卜素素415（（橙橙））2.1 ×10511番茄红素番茄红素470（（红红））1.9 ×105    max结构式结构式化合物化合物 5.2×1043.5×1042.1×1041.0×104 296 258 217 185 C＝＝C 辛四烯辛四烯 己三烯己三烯 丁二烯丁二烯 乙烯乙烯43苯吸收带（溶剂：异辛烷）苯吸收带（溶剂：异辛烷）精细结构精细结构B带带(III)K带带(II,E2)E带带(I,E1)I带带II带带III带带E带带K带带B带带E1带带E2带带B带带1802042566.0×1048.0×1032.0×102 max  苯吸收带名称苯吸收带名称44苯环共轭的影响苯环共轭的影响B带，带， max(nm)苯苯256萘萘314蒽蒽380丁省丁省480(黄黄)戊省戊省580(蓝蓝)45苯的同系物的吸收光谱苯的同系物的吸收光谱 /nm 46  Kmax＝＝220nm，， Bmax＝＝270nm ε＝＝800非共轭非共轭(两环不共平面两环不共平面)λBmax＝＝262nm，，ε＝＝500 非共轭非共轭(sp3杂化杂化)隐式孔雀绿隐式孔雀绿(sp3杂化杂化)(无色无色)碱式孔雀绿碱式孔雀绿 (三苯环共平面三苯环共平面)(sp2杂化杂化)(绿色绿色) λmax＝＝617nm 苯环取代基的影响苯环取代基的影响CH2CH3CH3CHN(CH3)2(CH3)2N(CH3)2NC+N(CH3)2Cl-2,2  -二甲基联苯二甲基联苯二苯甲烷二苯甲烷478.6.3 溶剂极性对吸收光谱的影响溶剂极性对吸收光谱的影响对称四嗪对称四嗪的吸收光谱的吸收光谱1.蒸气状态蒸气状态2.环己烷中环己烷中3.水中水中4.(溶剂化溶剂化,精细结构消精细结构消失失)NNCNNCHH500600 (nm)12349酸碱性导致物质结构发生变化酸碱性导致物质结构发生变化例：例：PP+ H＋＋+ OH－－HOCOHCOO-sp3（无色）（无色）-OCCOO-Osp2（红色）（红色）OH50溶剂极性增大溶剂极性增大， n   * 吸收吸收蓝移蓝移例例: :丙酮丙酮溶剂溶剂己烷己烷氯仿氯仿二氧六环二氧六环乙醇乙醇水水 max(nm)280278277270265±2丙酮的丙酮的UV吸收光谱图吸收光谱图溶剂效应（形成氢键）溶剂效应（形成氢键）无溶剂效应无溶剂效应 E1 E2 E2 E1> max蓝移蓝移水水乙醇乙醇己烷己烷A 51溶剂极性增大溶剂极性增大，     * 吸收吸收红移红移CH3溶剂效应溶剂效应无溶剂效应无溶剂效应 E1 E2 E2 E1< max红移红移  异亚丙基丙酮异亚丙基丙酮例：例： 异亚丙异亚丙基丙酮基丙酮305309315329n   *243237238230    *水水甲醇甲醇氯仿氯仿正己烷正己烷溶剂溶剂极性增大极性增大 max蓝移蓝移 max红移红移52溶剂极性影响的结论溶剂极性影响的结论:1. 非极性溶剂可见精细结构非极性溶剂可见精细结构;2. pH影响分子构型影响分子构型, 因此影响物质对光的吸收因此影响物质对光的吸收.3. 利用溶剂效应可区别利用溶剂效应可区别     *(红移红移) 还是还是 n   *(蓝移蓝移);4. 比较光谱时比较光谱时, 溶剂要相同溶剂要相同.53常用溶剂的光学透明区常用溶剂的光学透明区CHCl3245乙醚乙醚210苯苯280环己烷环己烷210己烷己烷210CCl4265正丁醇正丁醇210庚烷庚烷210DMF270二氯甲烷二氯甲烷235甲醇甲醇215丙酮丙酮330二氧六环二氧六环235异辛烷异辛烷210吡啶吡啶303乙醇乙醇210水水191硝基甲烷硝基甲烷380大于以上波长时使用大于以上波长时使用对溶剂的要求对溶剂的要求1. 低极性低极性 2. 易溶解被测物易溶解被测物3. 稳定稳定 4. 在样品的吸收光谱区无明显吸收在样品的吸收光谱区无明显吸收54习习 题题55。