茚三酮法测氨基酸.doc

茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：　凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质二．仪器：721型分光光度计　台天平 减压蒸馏器 干燥 容量瓶 移液枪　烧杯 试管架　　　　　　　　　　　 试管 水浴锅三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成用pH 检查校正3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

1234560.3mmol/L标准氨基酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.202mol/L醋酸缓冲液111111茚三酮显色液111111OD570混匀，盖住试管口后在100水浴加热15min，然后用自来水冷却放置5min 后，加入3ml60%的乙醇稀释，充分摇匀2．氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。