水稻愈伤组织的诱导及应用文献综述.doc

文献综述水稻愈伤组织的诱导及应用一前言部分1.1关于水稻愈伤组织的简介水稻是人们重要的食粮之一，由于其基因组小，通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因 克隆、基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物.生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞 培养是获得转基因植物的最好来源.因此，建立一个高效再生体系是实现基因转化的先决条件⑴.近 年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株.虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈 伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化、品神培育中〔"I.但上述 材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展.1.2组织培养所谓的植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基对离体的植物器 官组织细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术叫其研究的类型主要包括组织 培养、器官培养、细胞培养、及原生质体培养随着研究T作的深入进展，上述5个方面的研究理论 和技术体系逐渐得到完善促使植物组织培养的应用范围口益广阔延伸组织培养作为一种育种技术 在水稻等重要粮食作物己广泛应用，并培育出一大批优良品种，自1965年我国开展水稻细胞培养研 究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤 其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具 有重要作用。

再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、 抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质远源杂种植物的产生，是指 由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功采用胚的早期离 体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种植物的快速繁殖，是指利用 植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法植 物快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛，产生经济效益最大的研究领域，涉及的 植物种类繁多，技术廿益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂育苗的 梦想植物种质资源的离体保存，即从20世纪60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技 术，进行了离体保存神质的研究种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞 或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长， 并再生植株的方法为了创造新的种质资源，组织培养及基因工程技术被广泛用于水稻育种研究， 并取得了显著成果，如现代生物技术育种过程中常作为外源基因的受体的愈伤组织，其质量的好坏 及其分化植株能力的高低直•接影响肴水稻基因T.程的进展和水稻种质资源的创新。

在改善愈伤组织 质量和提高植株再生能力方面，科学工作者也进行了大量研究并得到了一定的成果勺目前水稻的 组织培养己在单倍体育种、诱变育种、体细胞杂交及遗传转化等方面得到应用二主题部分2.1愈伤组织的形成从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期起动期 是指细胞准备进行分裂的时期用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态起 动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞 的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤 口上会出现愈伤组织在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植 体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果 很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2, 4.二氯苯氧乙酸、茶乙酸、 凹|噪乙酸和细胞分裂素等分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生了细胞的过程处于分裂期的愈 伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。

例如，烟草、胡萝卜等 植物的脱分化比较容易，禾木科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较 难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难2.2水稻愈伤组织的诱导水稻成熟胚愈伤组织诱导中普遍采用的基木培养基主要有MS、N6和B5等培养基培养温度 一般为22〜28C, 25C左右最佳；光照强度为1 500〜2 ()0() Lx,可以选用I I光灯或白炽灯，光照时间 10〜12 h或全黑暗培养均可，10〜30d可诱导出愈伤组织在水稻成熟胚的愈伤组织诱导过程中，为了保持愈伤组织的高速生长，常用到生长素类和细胞 分裂素类物质其中2,4.D是禾谷类作物愈伤组织诱导中唯一不可缺少的激素种类，其作用的适宜 浓度范围为0.5-5.0 mg/L,也有例外在附加有6.0 mg/L 2,4.D和0.5 mg/L KT的MS培养基上诱导出 了大量小麦幼胚胚性愈伤组织在培养基中添加一定浓度的ABA,对抑制胚芽和根的生长有明显效 果，且能显著提高成熟胚愈伤组织的诱导率，ABA浓度为2mg/L时诱导率最高当ABA浓度大于 5mg/L后，其愈伤诱导率开始下降通常通过成熟胚诱导的初生愈伤组织并不适于悬浮细胞培养，一般需要3〜6周的继代培养，改 良愈伤组织的形态。

为了获得松脆，小颗粒和快速生长愈伤组织细胞，也可以采用相对较短的继代 周期或将大块愈伤组织央碎摊平等物理手段固体继代次数对细胞悬浮系的建立至关重要有研究 表明，愈伤组织在固体培养基上继代7次后形成的悬浮系与继2次后形成的悬浮系相比，前者明显 好于后者，适当地增加继代次数有利于愈伤组织细胞形态的改变2.3提高水稻愈伤组织植株再生能力的几种方法在农作物育种工作中，除了传统的自然选存外，创造变异是作物育种的一个必要步骤离体培 养使植物细胞产生变异，这种变异由澳大利亚学者Larkin和Scowcroft于1981年定名为体细胞无性系 变异目前，应用体细胞无性系变异进行水稻育种的工作在国内已取得了许多重要成果［6罚在目前对细胞无性系还难以进行定向诱变的情况下，仓腊尽可能多的变异以供选择是细胞无性 系变异育种的首要任务在细胞离体培养中创造更多的变异有两种主要方式，第1种是在开始时就采 用大量的外植体材料诱导愈伤组织的形成，再经过1・2次的继代增殖培养后诱导愈伤组织产生大量的 植株；第2种方式是在开始时只采用少量的外植体材料进行愈伤组织的诱导培养，但愈伤组织在经过 多次的增殖继代培养后才进行诱导植株再生的培养。

从现有的对细胞无性系变异规律不多的了解中, 我们认为，这两种方式产生的无性系再生植株群体是有差别的可能的情况是，相对于第2种创造变 异的方式，在第1种方式产生的群体中，不仅总体的变异频率低，而且变异谱也较狭窄，相同或相近 似的变异个体出现频度高显然，第2种方式更有利于育种选择但是，采用第2种方法往往由于长 期继代培养的愈伤组织植株再生能力的显著下降而难以得到大量的再生植株，刻意延长培养时间以 创造变异的策略往往由于组培技术的限制而无法实施为了解决细胞在培养过程中植株再生能力逐渐降低的问题，使离体细胞在培养后期产生的变异 也能够通过植株再生而在育种中得到应用，不少科学家对培养方法进行了改造和创新，并取得了一 定进展但是，由于采用的实验材料各不相同，这些实验结果之间没有可比性而缺乏普遍的指导意 义木研究选用文献报道的脱水处理⑼、添加亚精M,1(\添加山梨醇或甘露醇1山、两步分化法3】、几种方法，对相同实验材料进行培养比较，以寻求相对高效和可靠的植株再生培养方法2.4愈伤组织培养的应用愈伤组织培养作为一种最常培养形式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他儿种 培养形式最终都要愈伤组织才能产生再生植株，而且，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质 体的。

因此，愈伤组织培养具有多神用途一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规 律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培 养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等实践证 明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产 的理想途径2.5目前水稻组织培养中存在的问题在水稻组织培养方面，我国科学家己克服了一道道难关，但在发展中还存在一系列问题，有待 进一步探索例如在目前的技术水平下，对水稻细胞无性系还雉以进行定向诱变，直至目前还没弄 清体细胞无性系变异的规律，给细胞无性系变异育种带来一定的困难|⑶水稻的愈伤组织是进行遗传转化改良水稻品质的重要方•法之一但是长期继代培养引起愈伤组 织再生能力衰退是一个已被很多学者所认识和重视的问题，针对其衰退的原因也有比较深入的生理 生化研究［14-171,但笔者认为它仍是一个有待进一步研究攻关解决的问题在水稻的组织培养和器官培养中花药离体培养作为一种新的育种手段，在水稻育种中得到应 用我国是世界上首先将水稻花培品种应用于生产的国家，现已有成一批优质高抗的水稻优良品种, 并取得了较好的经济效益和社会效益。

花药培养诱导出的单倍体，表现出双亲性状的各种重组类型, 通过自然加倍或人工加倍，可以在当代获得稳定得纯合二倍体，大大加快了育神速度但在实际操 作中，由于受培养基组分、材料的差异性以及培养环境的影响，往往获得的再生植株群体较小，使 选择受到较大的限制"叫 并且水稻花药培养会产生大量的白化苗，有的甚至达80%—90%,成为花 药培养研究和育种的重要障碍，以上诸多原因都是水稻的组织和器官在离体培养的情况下，建立禾 本科植物再生体系以及转基因育神中存在的问题参考文献[1] 杨跃生，简玉瑜.影响水稻愈伤组织再生植株数量和质量的因素【J].农业生物技术学报，1996, 4(2):124-127.[2] 赵成章.水稻体细胞组织培养在品种改良上的应用[J].中国农业科学,1984(5):35-40.[3] 大野青春.组织培养用于水稻改良[J].国外农学——水稻,1996(1):7-10.[4] 王蒂.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社.2004： 1-2.[5] 杨跃生，简玉瑜.影响水稻愈伤组织再生植株数量和质量的因素[J].农业生物技术学报,1996.4(2)：124-127.[6] 范树国，梁承邺，刘鸿先.稻离体育性变异研究口].植物学通报,2000,17(3): 232-241[7] 凌定厚，马镇荣.由离体培养获胞质型水稻雄性不育系的可恢复变异[J]科学通报,2000, 45(13):1400-1401.[8] 高东迎，孙立华,朱永兰，等.水稻细胞突变体HX-3无性系的变异[J]江苏农业学报,2002,18(2):65-70.[9] 杨岳生，筒玉瑜.脱水处理对水稻培养组织植株再生的高效调控作用[A].农业科学集刊：第二集[C]. 北京:中国农业出版社,1995.40-47.[10] BajajS,RajamMV.Efficient plant regeneration from long-term callus cultures of rice by spermidine [J], Plant Cell Report,!995,14:717-720.[1 IJKishor P B K,Reddy G H.Retention and revival of regenerating ability by osmotic adjustment in long-term cultures of four varieties of rice| J] Journal of Plant Physiology, 1986,126:。