质谱分析蛋白质的相互作用.doc

蛋白质的相互作用蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要 生理活动 的基础其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为 1 个大的生物复合体的一部分，与细胞 完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程研究蛋白质间相互作 用的方式 和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的 解决因此，确定 蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点近年来有许多 方法被用于蛋白质相互作用 的研究， 酵母双杂交技术， 免疫共沉淀技术， 串联亲和纯化技术， 化学交联技术， 蛋白质芯片技术，荧光共振能 量转移技术，噬菌体展示技术等酵母双杂交技术Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的 转录激活因子， 从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功 能酵母双杂交系统可在 全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。

免疫共沉淀技术免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的 Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的 Fc 片段的现象开发出来的方法其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再 加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合 物：“目的蛋白一兴趣蛋白一抗兴趣蛋白抗体一 Protein A或G',经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白这种方法得到的目的蛋 白是在细胞内与 兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高这种方法常用于测 定两种目标蛋白质是否在体内结 合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档串联亲和纯化技术串联亲和纯化(TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术，经过两步特异性亲和纯化，可快速得到生 理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质该技术通过在靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAPtag)， 不破坏靶蛋白质调控序列，且靶蛋白质表达量与体内水平相当；经过两步连续的亲和纯化获 得接近自然条件的特定蛋 白质复合体，后用质谱技术或 Edman 降解法进行蛋白质鉴定。

与传统的研究蛋白质 相互作用的技术相比， TAP 技 术具有周期短、假阳性结果少等优点化学交联技术交联剂是能型分子间起架桥作用从而使多个线型分子相互键合交联成网络结构的物质 促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质化学交联剂是能够和蛋白质反应的带有双功能团的化学试剂 通过功能 团和氨基酸残基反应，偶联两个蛋白质或者更多的蛋白质形成网状交联功能团决定了交联剂的反 应特异性 化学 交联试剂捕获感兴趣的发生了相互作用的蛋白质对，结合生物质谱的高解析能力，快速、高 通量地获取蛋白质高级结 构信息蛋白质芯片技术 蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，是由固定于不同种类支持介质上的蛋白微阵列组成，阵列中固定分 子的位置 及组成是已知的，用未经标记或标记 （ 荧光物质、酶或化学发光物质等标记 ） 的生物分子与芯片上的 探针进行反 应，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理蛋白质芯片具有以下特点 : 1） 特异性强这是由抗 原抗体之间、蛋白与配体之间的特异性结合决定的； 2） 敏感性高可以检测出样品中微 量蛋白的存在，检测水平已 达 ng 级； 3）通量高在一次实验中对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高； 4） 重复性好；不同次实验间相同 两点之间差异很小； 5） 应用性强。

样品的前处理简单，只需对少量实际标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测； 6）适用范围广适用于包括组织、细胞系、体液 在内的 多种生物样品荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移（FRET）是指两个荧光基团间能量通过偶极一偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体 的现象，可被用于测定分子间的距离 FRE 荧光探针主要有荧光蛋白、有机荧光染料、镧系染料和量子 点，FRE方法的特点是适用于活细胞和固定细胞的各类分子，灵敏度和分辨率高，并能清晰成像，最直观地提供蛋白 质相互作用的定位和定量信息，因而受到广泛重视噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种亲和选择和基因表达产物相结合的技术，以改造的噬菌体为载体，将外源多肽或 蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的 DNA& 位于 该病毒粒子内，通过检测病毒内部的DNA来测定融合蛋白序列噬菌体展示技术使大量随机多肽与其 DN编码 序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子的多肽配体通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速鉴定 下面举一 个具体的例子来说明酵母双杂交技术的应用酵母双杂交技术 水稻条纹叶枯病是东亚地区普遍发生的毁灭性水稻病害，被称为水稻上的“癌症”。

其病原是水稻条纹病毒（RSV，RSV具有独特的基因组结构和编码策略，它由4条RN/链组成，其核苷酸共参与编码7个蛋白，包括 RdRp NS2 NSvc2、CP NS3 SP NSvc4在本实验中，研究NS与CR SR NSvc4勺互作，为进一步探 讨水稻条纹病毒 的致病机理提供依据材料：水稻健康和感病幼苗由福建农林大学病毒研究所培育大肠杆菌 DH5x为本实验室保存，克隆载体pMD18-T购自TaKaR公司酵母双杂交试剂盒购自Clontech公司，其中包括载体pGADT7pGBKT7pGBKT7-53 pGBKT7-Lam pGADT7-T pCL 载体质粒和酵母菌 AH109 诱饵质粒 pGBKCP pGBK-SP pGBK-NSvc4 pGADT7-CP为本实验室保存1 方法1.1 目的基因 NS3 的获得称取感病水稻叶片组织 1.0 2.0g ,用 Trizol 法提取总 RNA 具体操作按照试剂 盒说明进 行以病叶总 RNA 为模板，以 R1 为引物反转录合成第一链 cDNA 然后以 F1/R1 （F1: GGACTAGTATGAACGTGTTCACATCGRITGTEGATCCCTACAGCACAGCTGGAG 物 GC T 扩增目的基因 NS3 在1.0 %琼脂糖凝胶电泳后，按照 QIAEXn Gel Extration Kit （QIAGE 公司产品）回收纯化说明书回收目的片段。

1.2 NS3S 隆载体的构建将上述回收产物与 PMD-18 载体连接，16 C 过夜，然后将连接产物转化到大肠杆菌 DH5 a 感 受态细胞，涂布于LB平板，于25C培养过夜（16 24 h），经过蓝白斑筛选后，对阳性克隆菌落提取质 粒并进一步 PCI 和酶切鉴定将实验获得的重组子命名为 pMD-NS31.3 NS3 酵母表达载体的构建用限制性内切酶 Spel 和 BamH 分别双酶切两个重组子 pGADT7-C 和 PGBKT7- CP 同时用 Spel/BamHI 双酶切重组子 pMD-NS3 琼脂糖凝胶电泳后，回收相应的目的片段 pGADT 和 pGBKT 及 NS3 然后用 T4DN 连接酶将 NS3 与同样酶切回收的酵母双杂交载体 pGADT 和 pGBKT 分别连接，于 16 C 过夜，将连接 产物转化大肠杆菌DH5x，分别涂布于LB/Amp LB/Kan平板，筛选转化子，然后用PCI和酶切鉴定插入片段，获得 重组质粒 PGAD-NS 和 PGBK-NS3 最后测序，鉴定插入片段是否与目的基因一致1.4 重组质粒对 AH10 细胞毒性检测以含有空载体 pGBKT 或 pGADT 的酵母菌 AH10 为对照，比较含有不同 重组质粒的酵母菌在 SD/-Trp 或 SD/-Leu 培养基中的生长情况，来检测各重组质粒表达产物对细胞的毒性情况。

实验通 过比较 SD/-Trp 或 SD/-Leu 固体培养基上菌落的生长速率和克隆数来进行鉴定，或通过 SD/-Trp 或 SD/-Leu 液体培养 基进行鉴定方法为： 分别挑取1个较大的单克隆菌落（2 3mrj）接种于含有50mLSD/-Trp/Kan （20 "g/mL）液体培养基的锥形瓶中；30C，200 r/min，过夜培养（16 24h）;取少量培养物，用紫外 分光光度计检测OD如果0总°远远小于0.8,说明重组质粒对细胞可能具有毒性1.5 NS3 蛋白自激活活性的检测活化酵母菌 AH109 按照酵母双杂交手册进行制备酵母感受态细胞分别 取 5 卩L重组质粒PGAD-NS3 PGBK-NS、阳性对照质粒pCL1阴性对照质粒pGADT7与10卩L herring tests carrier DNA 充分混合后，转化到酵母菌 AH109 感受态细胞，具体操作按照酵母双杂交手册进行其中 PGAD-NS3 阳性对照 pCL1、阴性对照pGADT7转化产物分别涂布于SD/-Leu、SD/-Leu-His-和SD/-Leu-Ade-平板PGBK-NS3转化产物 涂布于SD/-Leu-Trp、SD/Leu-Trp-His-、SD/Leu-Trp-His-Ade-营养缺陷型平板，于30 C培养箱倒 置培养3 4d,用 无菌牙签挑取 SD/-Leu 和 SD/-Leu-Trp 平板上的菌落分别划线或者涂布于 SD/-Leu/X- a -Gal 和 SD/-Trp/X- a-Gal 平板 上，观察菌落生长情况及变蓝情况，从而鉴定蛋白 NS 有无自激活活性。

1.6 酵母双杂交检测 NS31 白自身及与 CPSRNSvc4 的互作将重组质粒 PGAD-NS3/PGBK-NQ3GBK-CP/PGAD - NS3、 pGAD -CP/PGBK -NS3 pGBK -SP/PGAD -NS3 pGAD -SP/PGBK -NS3 pGBK -NSvc4/PGAD -NS3 pGAD - NSvc4/PGBK -NS3 及阳性对照质粒 pGADT7/pGBKT7-53 阴性对照 pGADT7/pGBKT7-Lar 分别共转化到 AH109 感受态细胞,转化产物分别涂布于 SD/-Leu -Trp 、SD/Leu -Trp -His 、SD/Leu -Trp-His-Ade- 营养缺陷型培养 基，于 30C倒置培养3 4d，观察菌落生长情况，用无菌牙签挑取平板上生长的菌落转接于SD/Leu-Trp-His-Ade-/X-a -Gal 平板，于 30C 继续培养，看其生长及变蓝情况，以鉴定 NS31 身及与 CP SRNSvc4 之间是否存在互作目前,研究蛋白一蛋白相互作用最经典的方法当属酵母双杂交技术该技术几乎能进行整个细胞内的蛋 白质相互 作用的筛选,包括膜蛋白 转录活性蛋白以及定位于不同亚细胞结构的蛋白。

它具有简便 灵敏 高效 高通量和价格相对 低廉的特点但该方法也存在有一定的局限性首先,许多已知的相互作用并没有 在大规模的筛选中被鉴定出来，表 明这种方法存在这较高的的假阴性，其主要原因有：筛选方法不同检测到 的蛋白间的互作也不同例如经典的酵母的 双杂交系统只能检测到核内蛋白，对胞质蛋白和膜蛋白则检测不 到；融合的报告蛋白很可能空间排列受阻，从而影响 蛋白的互作；有些蛋白间的互作是瞬间发生的，目前一 些方法很难检测到，高级的真核生物在酵母中表达的蛋白缺乏 转录后修饰，因此发生的互作很难检测到；报告基因的缺陷；RNA聚合酶1的变化等等其次，假阳性可以反映蛋白 质间非特异性相互作用，也就是说捕获 蛋白能与许多不同的诱饵蛋白相互作用，即薪性捕获，这可能是由于有些蛋白 。