q-pcr常见问题及解决方法.doc

QPCR常见问题及其分析解决方法　　一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：　　1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度　　2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差最好能在冰上操作　　3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！　　4. 所有成分加完后，离心去除气泡　　5. 每个样品至少3个平行孔　　参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正　　通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集　　3. 仪器设置　　所有仪器的操作都基本一致设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：　　A. 首先是实验目的选择：定量还是其他我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验　　B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。

　　C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称　　D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组以及负对照的设置和生物重复的设置　　E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备　　F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以或者是仪器说明书上建议的程序　　G. 反应体系的设置：　　A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应　　需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开要根据不 同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”　　设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！　　五、Real-time qPCR数据分析　　1. Real-time qPCR常见参数　　基线（baseline）　　通常是3-15个循环的荧光信号　　同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线　　阈值（threshold）　　自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍　　手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

　　同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值　　Ct值:与起始浓度的对数成线性关系　　分析定量时候一般取Ct:15-35太大或者太小都会导致定量的不准确　　Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值　　△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）　　2.影响Ct值的关键因素　　模板浓度　　模板浓度是决定Ct的最主要因素控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间　　反应液成分的影响　　任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度　　PCR反应的效率　　PCR反应的效率也会影响Ct值在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的　　3. 如何评估实时定量PCR反应的效果　　PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

　　常见问题　　1. 无Ct值出现　　检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号　　引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性　　模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起　　模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况　　2. Ct值出现过晚（Ct>38）　　扩增效率低: 反应条件不够优化设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等　　PCR各种反应成分的降解或加样量的不足　　PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度　　3. 标准曲线线性关系不佳　　加样存在误差: 使得标准品不呈梯度　　标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品　　引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针　　模板中存在抑制物，或模板浓度过高　　4. 负对照有信号　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　5. 溶解曲线不止一个主峰　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增　　6. 扩增效率低　　反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解　　反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法　　反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响　　7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？　　判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性　　如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析　　8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？　　参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)　　模板的浓度太高或者降解　　荧光染料的降解　　荧光定量PCR问题汇总　　1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑　　2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：　　3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？　　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块当硬盘驱动器上文件以 分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一 起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能　　碎片整理的方法如下：　　· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。

　　· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property　　· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)　　· 单击碎片整理(Defragment)　　· 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）　　· 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）　　· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤　　4. 何时执行windows service pack更新？　　不要执行该操作除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题　　5. 应该备份哪些数据？　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。

下图是校正文件的样本　　6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器　　通风：仪器的通风应该没有阻挡　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机　　空间：易于操作，安全　　7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染　　清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中　　吹打数次　　将废液吸入废液杯中　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次　　确认反应孔中的残留。