游离氨基酸测定(完整版).doc

总游离氨基酸测定（完整版）实验原理：游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化 合物二酮茚-二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比， 用分光光度计在570nm下测其含量因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定 前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉.仪器与用具：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶 研钵；刻度吸管：0.1ml x 1、 1ml x 2、2mlx 2、5mlx 1；沸水浴；具塞刻度试管 20mlx 10；分光光度计.一、试齐I」1. 水合茚三铜：称重结晶的茚三铜0.6g,装入烧杯，加入正丙醇15ml，使其溶解加入正丁醇30 ml、乙二醇60 ml、乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=5.4） 9 ml, 混匀，棕色瓶冰箱保存，10天内有效2. 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取化学纯乙酸钠 54.4g，加入无氨蒸馏水100 ml，电炉加热至沸，使其体积减半，冷却后加冰乙酸 30 ml，加蒸馏水定容至100 ml3. 氨基酸标准溶液：精确称取 80C烘干至恒重的亮氨酸0.0234g溶于10%异 丙醇并定容至50ml取此液5ml蒸馏水稀释到50ml，即为5卩g/ml氨基酸 标液。

4.0.1%抗坏血酸：称取0.050g抗坏血酸，溶于50 ml蒸馏水中，即配即用5.10%乙酸、标准曲线制备试剂管口123456氨基酸标液5g/ml00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水2.01.81.61.41.21.0水合茚三铜3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸0.10.10.1 :0.1 t0.10.1每管含氮量012345加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不 时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去 ，待呈现兰紫色 时，用60%乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色以吸光度为纵坐标，氨基氮 ug 数为横坐标，绘标准曲线三、实验步骤：1•烟末0.5g于研钵中加入5 ml10%乙酸，研磨匀浆后用蒸馏水定容100 ml,用滤纸过滤到三角瓶中备用2. 1ml 滤液加入到 20ml 干燥试管中，加 1 ml 蒸馏水，水合茚三铜 3ml, 0.1%抗坏血酸 0.1ml, 加塞子密封于沸水中加热 15 分钟，取 出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐 氧化褪去，待呈现兰紫色时， 用 60％乙醇定容至 20ml， 摇匀于 570nm 波长下比色。

四. 计算：求三重复的平均值，由标准曲线得知各样的氨基酸 ug 数，代入公式计算氨基酸含量（mg/g干样）=｛氨基酸ug数x（提取液总体积/测定体积）｝ / （样品g数x 1000）。