基础生物学实验（三）：实验十 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察.ppt

实验一  小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察•【目的要求】•1.掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方法•2.了解一些实验动物染色体的形态和数目【【实验材料】】•实验器材u恒温培养箱、恒温水浴锅、普通离心机、显微镜、天平、离心管(5～10 mL)、试管（10mL）注射器(5 mL)、4号针头、100 mL烧杯、毛细滴管、培养皿、试管架、酒精灯、搪瓷托盘u载玻片 （冰片）•实验动物u健康小鼠(Mus musculus 2n=40)，体重约18～20g，雌雄不限 •试剂 u甲醇、冰乙酸、 Giemsa染液、秋水仙素、KCl、生理盐水 •1.动物预处理：实验前动物预处理：实验前2～～4小时注射秋水仙素，按小时注射秋水仙素，按小鼠体重小鼠体重4-5微克微克/克腹腔克腹腔注射使细胞分裂停止于使细胞分裂停止于中期，增加中期分裂相中期，增加中期分裂相秋水仙素用量要注意秋水仙素用量要注意,太多太多或处理时间过长，会导致或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破体形态不正常，甚至被破坏或溶解坏或溶解 【【内容与方法内容与方法】】•2.取材及收集细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，取材及收集细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，剪开后肢皮肤和肌肉，取出完整股骨，剔剪开后肢皮肤和肌肉，取出完整股骨，剔除肌肉、肌腱，生理盐水洗净；剪去少许除肌肉、肌腱，生理盐水洗净；剪去少许股骨头，吸取股骨头，吸取4ml37℃℃预温预温0.075mol/L KCl低渗液低渗液冲洗两个股骨的骨髓细胞至冲洗两个股骨的骨髓细胞至同一试同一试管管。

•3.低渗：用低渗：用毛细毛细吸管将收集液充分打匀，置吸管将收集液充分打匀，置37 ℃℃低渗处理低渗处理20-30分钟低渗过度，细胞低渗过度，细胞核质会提前破裂，染色体丢失；低渗不足核质会提前破裂，染色体丢失；低渗不足则染色体在一起，分散不开则染色体在一起，分散不开 •4.预固定：预固定：现配固定液甲醇、冰醋酸（现配固定液甲醇、冰醋酸（3：：1））1ml，打匀，离心，打匀，离心8分钟（分钟（1000r/min），），弃上清•5.固定：固定液固定：固定液5ml，打匀，室温静置，打匀，室温静置20min，离心，弃上清离心，弃上清使染色体结构清晰使染色体结构清晰•6.再固定：省略再固定：省略•7.制备细胞悬液：留制备细胞悬液：留4~5滴，吸管缓慢打匀滴，吸管缓慢打匀•8.滴片：载玻片乙醇冰浴，吸取少许细胞悬滴片：载玻片乙醇冰浴，吸取少许细胞悬液，用重力作用将染色体滴散开，立即吹液，用重力作用将染色体滴散开，立即吹散液体，烤至稍干即可散液体，烤至稍干即可滴片时的高度很滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量体的准确数量。

预冷的玻片预冷的玻片冰片不要擦干，甩去多冰片不要擦干，甩去多余水分即可，即取即用余水分即可，即取即用•9.染色：染色：Giemsa染液染液10min，细流冲洗，，细流冲洗， 干燥•10.镜检：镜检：2n＝＝40，都为端，都为端着丝粒染色体着丝粒染色体•【【思考题思考题】】•1．制片过程中低渗处理的作用？低渗的时间长短对染色体．制片过程中低渗处理的作用？低渗的时间长短对染色体制片效果有何影响？制片效果有何影响？•2. 在取骨髓前为什么要给动物注射秋水仙素在取骨髓前为什么要给动物注射秋水仙素?•【【实验报告实验报告】】•1.思考题•2.制备好的滴片，有细胞的一面贴好胶布写上学号姓名，制备好的滴片，有细胞的一面贴好胶布写上学号姓名，观察后放入片盒观察后放入片盒•3.绘图：绘出一个小鼠骨髓细胞的中期分裂相绘图：绘出一个小鼠骨髓细胞的中期分裂相 •1.动物预处理：实验前动物预处理：实验前2～～4小时注射秋水仙素，按小鼠体重小时注射秋水仙素，按小鼠体重4微克微克/克腹腔注射克腹腔注射•2.取材及收集细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，剪开后肢皮肤和肌肉，取出完整股取材及收集细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，剪开后肢皮肤和肌肉，取出完整股骨，剔除肌肉、肌腱，生理盐水洗净；剪去少许股骨头，吸取骨，剔除肌肉、肌腱，生理盐水洗净；剪去少许股骨头，吸取4ml37℃℃预温预温0.075mol/L KCl低渗液低渗液冲洗两个股骨的骨髓细胞至冲洗两个股骨的骨髓细胞至同一试管同一试管。

•3.低渗：用吸管将收集液充分打匀，置手中低渗处理低渗：用吸管将收集液充分打匀，置手中低渗处理20分钟•4.预固定：预固定：现配固定液甲醇、冰醋酸（现配固定液甲醇、冰醋酸（3：：1））1ml，打匀，离心，打匀，离心8分钟分钟（（1000r/min），弃上清•5.固定：固定液固定：固定液3～～4ml，打匀，室温静置，打匀，室温静置20min，离心，弃上清离心，弃上清•6.再固定：省略再固定：省略•7.制备细胞悬液：留制备细胞悬液：留4~5滴，吸管缓慢打匀滴，吸管缓慢打匀•8.滴片：载玻片乙醇冰浴，吸取少许细胞悬液，用重力作用将染色体滴散开，滴片：载玻片乙醇冰浴，吸取少许细胞悬液，用重力作用将染色体滴散开，立即吹散液体，烤至稍干即可立即吹散液体，烤至稍干即可•9.染色：染色：Giemsa染液染液10min，冲洗，，冲洗，(60℃℃烘干烘干)•10.镜检：镜检：2n＝＝40，都为端着丝粒染色体都为端着丝粒染色体附：•溶液配制：Ø生理盐水0. 9% NaCl ：称9克NaCl溶于少量蒸馏水中，定容至1000mLØ0.01％秋水仙素：称10 mg秋水仙素，溶于100 mL生理盐水中Ø低渗溶液：称5.59克KCl溶于1,000 mL蒸馏水中，其浓度为0.075M。

•Giemsa母液：将吉姆萨粉末0.75g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，将全部(50mL)剩余甘油倒入于56℃温箱内保温2h然后再加入甲醇50mL，搅匀后保存于棕色瓶中两周后可使用•母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好• 临用时用pH 6.8的0.025mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍•磷酸盐缓冲液配制： •KH2PO43.4克，溶于800mL蒸馏水中，用5%~10%的NaOH调pH至6.8，加蒸馏水定容至1000mL。