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HPV临床检测方法研究进展人乳头瘤病毒(Humanpapillomaviruses,HPV)是一种小型环状双链DNA病毒,其基因组分为3个区域,即早期转录区(E区,包含基因E1-E7)、晚期转录区(L区,包含基因L1和L2)和非编码区(也称长控制区,位于L1和E6开放阅读框架之间)[1]根据编码衣壳蛋白L1区基因序列差异,可将HPV分为不同亚型目前已检测出约280种亚型,其中有超过200种可感染人类[2,3]HPV是世界上最常见的性传播病毒,与肛门及生殖器恶性肿瘤和头颈部癌症[4]等全世界约5%的人类癌症有关,现已被确认为是下生殖道浸润前和浸润性癌症发展的必要因素,尤其是宫颈癌[5,6]宫颈癌是全世界导致女性死亡的第四大癌症,据估计,全世界每年新诊断出的病例为52.8万例[7]自2006年以来,针对HPV的安全、高效的预防性疫苗一直在市场上销售,但接种率较低,且对于已感染者无效[8]所以,早期筛查与干预是降低宫颈癌发病率与死亡率的有效手段与传统方法相比,HPV检测提高了癌前病变的早期检出率,并允许延长筛查间隔时间[9]目前诊断HPV感染主要依赖于分子生物技术检测HPV的DNA、RNA、癌蛋白等。

本综述旨在总结HPV检测的各种常用方法和试剂盒,分析它们在诊断宫颈病变和预测病变进展中的应用,以期为临床选择合适的HPV检测方法提供参考1、HPVDNA检测1.1第二代杂交捕获技术(hybridcapture,HC2)HC2于1992年获批,是最早获得美国食品药品管理局(foodanddrugadministration,FDA)批准用于HPV检测的方法,其原理基于对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测目前在国际上使用比较广泛,被认为是HPV检测的金标准[9],常作为其他HPV检测方法的参照比较HC2可检测13种高危HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)[10],半定量检测,操作方便,无需待检DNA扩增,结果准确且客观性强、重复性好,能避免一定程度的漏诊然而没有核酸扩增放大步骤,其检测灵敏度降低,不能确定HPV具体型别或区分单一感染和多重感染[11],与低危型HPV(6、11、53、67、70、82等)存在交叉反应,易产生假阳性结果Yin等[12]的一项meta分析表明,HC2在宫颈癌诊断中灵敏度为83%,特异性为71%并认为HC2可能提高宫颈癌诊断的准确性,但其检测结果应与常规检测结果和其他临床结果进行平行解读。

Koliopoulos等[13]研究表明HC2检测出的阴性结果比细胞学检查出的阴性结果更让人放心2018年8月1日,CareTMHPV体外检测诊断试剂完成临床验证,并获得WHO资格认证,可在全球推广该产品是世界首款通过WHO资格认证的适合发展中国家与地区的宫颈癌筛查体外诊断检测试剂,它基于HC2和磁珠捕获原理,检测14种高危亚型(包括HC2检测的13种高危亚型及HPV66亚型),优点是高效、简单、易于操作,对实验人员要求低且不需要特殊实验设施缺点是不对HPV进行分型和全定量检测CareTMHPV在精确确定女性是否患有癌症前期宫颈疾病的能力优于常规方法,其敏感度为90%,特异度为84.2%,性能接近发达国家和地区目前普遍使用的HC2有研究表明,CareTMHPV检测在检测宫颈上皮内瘤变2级(cervicalintraepithelialneoplasiagradeII,CIN2)的敏感性、阳性预测值和阴性预测值都要显著高于Pap涂片、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)法和阴道镜活检针对CIN2以及更高级别的病变,CareTMHPV检测与PCR在检测HPVDNA方面无明显差异[14]。

1.2实时荧光定量PCR检测法传统PCR技术是通过对HPVDNA中某一特定核苷酸序列进行指数级扩增,然后通过凝胶电泳技术对扩增产物进行定性分析目前有特异性引物和通用引物,前者针对HPV各亚型间E6、E7基因序列的差异设计,后者是依据不同HPV亚型共有的L1开放阅读框架(L1ORF)中的序列所设计,常用的通用型引物有MY09/11、GP5+/GP6+和SPF10该方法灵敏度高,但易受污染,假阳性率高,临床应用受限实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的累积进行实时监测DNA扩增反应,最后通过标准曲线对待检样品进行定量分析该技术能够在单一闭管体系中进行扩增、检测和定量,对特定类型的HPV敏感性极高,不仅实现了自动化,还极大地降低了扩增产物污染的概率,克服了传统PCR的缺点和局限性,用于诊断HPV感染有较好的临床价值缺点是工作量较大,需专人操作,设备及试剂均较昂贵,多种型别的HPV需多次检测2011年4月基于该技术与全自动样品制备的Cobas4800HPV检测获FDA批准,因操作方便简单被广泛用于临床Bottari等[15]研究表明,对CIN2进行检测,HC2和Cobas4800的灵敏度分别为95.2%和93.7%,特异性分别为72.4%和77.2%。

两者检测结果基本一致,都可用于临床检查而在Tranberg等[16]的临床验证中,Cobas4800HPVDNA检测家庭的自我取样具有高度可接受性,而且自我取样与全科医生采集的样本在HPV检测结果方面表现为良好的一致性,由此证明Cobas4800使用的方便性和高可接受度AbbottReal-TimeHRHPV检测原理与Cobas相同,通过荧光信号分别检测HPV16、HPV18和其他12种高危HPV亚型,同时以β-球蛋白作为内对照,可用于临床检测BDOnclarityHPV检测也是一种基于PCR技术的检测方法,它可检测14种高危亚型的E6/E7DNA,还可用于HPV16、18、31、45、51和52的单独基因分型或者(33/58)、(56/59/66)和(35/39/68)三个合并组的单独检测分析和临床表现的研究表明,这种检测方法在检测CIN2及以上的患者时,与HC2相比,两者的灵敏度和特异性类似[17,18]2014年,美国食品和药物管理局批准了BDOnclarityHPV检测与液基细胞学(Thinprepcytologictest,TCT)一起用于诊断21岁或以上的女性,以确定其是否需要转去做阴道镜检查。

1.3酶切信号放大技术(InvaderAssay)Invader技术是一种无需进行PCR、能对特定核苷酸序列进行信号放大的定性和定量检测技术其原理主要是在等温反应下,特异性HPV探针和侵入寡核苷酸片段与靶序列结合,上游探针3′端侵入到下游探针与模板杂交双链中形成一个侵入结构,Cleavase®酶可特异性识别并切割分子结构,释放出HPV探针的5′端碱基片段该碱基片段同体系中的荧光共振能量转移(FRET)探针结合,再次形成侵入结构,切割FRET探针的猝灭集团并释放出荧光基团,通过分子杂交和化学信号放大使其发出荧光,检测荧光信号来判断靶标是否存在该技术优点是检测HPV的L1和E6/E7区,避免仅检测L1区造成的假阴性,其采用内部质控评价样本细胞数,可避免因样本量不足引起的假阴性,采用核酸信号扩增检测,不存在扩增产物交叉污染的风险,对试样体积的要求较小[20]缺点是该检测分型试剂只检测HPV16和18亚型,分组不分型,不定量,不能区别其他亚型感染Cervista®HPVHR检测于2009年获得美国FDA批准,可定性检测14种高危HPV亚型,根据基因亲缘关系远近分类,即A5/A6组(HPV51、56和66)、A7组(HPV18、39、45、59和68)和A9组(HPV16、31、33、35、52和58)[19]。

Cervista®HPV16/18检测可单独分型检测16和18型HPV这两种试剂盒均适合用于30岁及以上女性的常规临床宫颈癌筛查以及宫颈病变的辅助确诊,能显著提高宫颈癌及其癌前病变高危人群的检出水平,从而降低宫颈癌的发病率和死亡率以及该病所带来的各种负担1.4芯片杂交技术或DNA/RNA微阵列芯片杂交技术原理是先采用HPVDNAE1区的通用型引物对HPV待测靶标基因进行扩增,然后将扩增产物变性同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,产生二维DNA探针阵列,与标记的扩增产物杂交,最后通过酶标记显色或荧光标记等方法进行HPV分型检测该方法可同时检测多种HPV型别,并且能够鉴定多重感染,具有高通量、速度快、所需样品少等优点与HC2检测的一致率达80.8%,一致性较好其灵敏度与特异性符合临床HPV分型检测要求,检测结果直观,非常适用于需要检出HPV具体型别的临床需求然而,由于采用了PCR扩增,并且需要进行开管多步操作,有传统PCR的缺点和局限性,即容易造成交叉污染,有产生假阳性结果的可能此外,该方法通常不能测定HPV病毒载量PapilloCheckHPV检测是一种基于PCR的DNA微阵列系统,可同时检测24种HPV亚型,包括18种高危型(包括HC2检测到的13种高危类型,以及73、82、53、66、70型)和6种低危型(6、11、40、42、43和44/55型)。

中国亚能公司的反向斑点杂交法是基于PCR和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术,可对23种HPV亚型(包括HC2检测到的13种高危类型,以及66、73、83、MM4、6、11、42、43和44/55型)进行分型检测凯普公司HPV试剂盒则是在PCR基础上通过导流杂交基因芯片技术,对21种HPV进行分型检测(比亚能少73、83和MM4,多低危型CP8304)还有罗氏公司的LinearArray®HPV基因分型检测和Genomica公司的CLART®HPVLine,不同产品可检测的亚型数量与分型不同2、HPVRNA检测检测HPVDNA只是识别感染,而E6和E7高度表达则标志着从感染到癌症的转变由E6、E7产生的癌蛋白可分别与细胞内p53和pRb结合,使pRb、p53丧失对细胞生长的调节作用,导致细胞永生化,这是恶性肿瘤发生的重要机制因此,靶向致癌蛋白E6和E7mRNA比靶向HPVDNA能够更加精确地预测病变向宫颈癌进展风险[21]HPVE6/E7mRNA检测可作为子宫颈癌筛查和调查的一种敏感而具体的工具[22]Aptima是第一个也是目前唯一一个经FDA认证的用于检测HPV-mRNA的技术,该方法是利用转录介导的扩增技术(transcriptionmediatedamplification,TMA)检测HPVE6/E7mRNA。

有AptimaHPV(AHPV)和AptimaHPV16/18/45Genotype(AHPVGT)两款检测试剂盒,分别于2011年和2012年获得美国FDA批准使用前者可以检测14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68),但不能具体分型后者可以区分检测HPV16型和18/45型,但对于HPV18/45型的HPV感染只能混合报告是否感染,无法区分具体的型别多项研究显示,在检测高级CIN方面,与HC2和Cobas4800HPV相比,AptimaHPV检测方法具有更大的特异性,且灵敏度没有降低[23,24]此外,AptimaHPV检测可用于ASC-US和LSIL患者的分诊,以此确定哪些患者需要进一步的阴道镜和活检诊断评估[24]所以,HPVE6/E7mRNA检测具有较高的特异性和阳性预测值,可用于预测HPVDNA不显著的感染,有助于避免使用激进的程序(宫颈活检和过度转诊),还可以降低患者的焦虑和随访期[25]但其检测费用更昂贵,而且存在交叉反应另一个基于核酸序列扩增技术的是PretectHPV-Proofer,可鉴定5种高危HPV亚型(HPVl6、18、31、33和45型)的E6/E7mRNA。

该方法特异性较高但临床敏感性较低,不适合用于。