实验一光学显微镜、微量吸管及改良牛鲍计数板使用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,实验一 光学显微镜、微量吸管及改良牛鲍计数板使用,一、光学显微镜使用与维护,【目的】,掌握显微镜的操作规程；了解光学显微镜的结构及原理；了解显微镜的保养方法一）显微镜的结构光学显微镜（以下简称为显微镜），是用来观察肉眼看不见的微小生物结构的虽然电子显微镜已经问世，但是，在目前一般的科学研究和教学中，显微镜仍然是重要的、较为精密的生物观察,仪器,为了正确操作、妥善保管和维护显微镜，使之延长使用年限，作为生物学工作者，必须了解显微镜的结构和功能机械部分,1镜筒是一个金属长筒，筒口上端安装目镜镜 头，下端装有镜头转换器和物镜镜头2镜头转换器是安装在镜简下端的一个旋转圆盘镜头转换器上有3-5 个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头3粗准焦螺旋位于镜臂的下方，可以转动，以便使载物台能上下移动，从而调节焦距4细准焦螺旋位于粗准焦螺旋外方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距5镜座位于镜臂下方，用以稳固和支持镜身5镜座位于镜臂下方，用以稳固和支持镜身6.镜臂上接镜筒，下连载物台，呈弓曲形为显微镜上的手握之处。

7载物台是放置玻片的平台其中央具有通光孔，载物台上有金属夹片夹，是用来卡住载玻片的夹子，转动左、右移动尺螺旋还可使切片在载物台上移动光学部分,1目镜是插在镜筒顶部的镜头，是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如 5、10、15和202物镜安装在物镜转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大物镜上刻有放大倍数，例如（4、10、25、40、100）等显微镜的放大倍数是目镜倍数乘以物镜的倍数3底光源位于底座上，开关位于底座侧方光线的强度可以调节4在镜柱前有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强5虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成，在较高级显微镜上具有此装置使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调一、使用方法,1观察前的准备,（1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为一寸左右镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察2）显微镜是光学精密仪器，在使用时要特别小心，使用前要熟悉显微镜的结构和性能，检查各总零件是否完好无损。

镜身有无灰尘，镜头是否清洁，做好必要的清洁和调整工作3）调节光源对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛晴天可直接用窗外的散射光，如明暗天气，可用830W日光灯或显微镜灯照明,调节光源及光照的一般步骤：,将低倍物镜旋至镜筒下方，旋转粗调节轮，使镜头和载物台距离约为0.5cm左右上升聚光器，使与载物台表面同样高否则使用油镜时光线较暗左眼看目镜，调节反光镜镜面角度（反光镜有凹平两面，光线较强自然光源，宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源，宜用凹面镜对光使全视野内为均匀的明亮度凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线,2低倍镜观察检查的标本须先用低信镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置1）先将标本玻片置于载物台上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节轮，下降物镜或上升载物台使物镜至标本0.5cm处2）左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节轮，当在视野内出现物象后，改用细调节轮，上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象然后认真观察标本各部位，确定并将需进一步要观察的部位移视野中央，准备用高倍镜观察。

3高倍镜观察；,将高倍镜转正至正下方，在转换接物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞然后由接目镜观察，再仔细调节光圈和聚光镜，使光线的明亮度适宜，同时再仔细正反两方向微转动细调节轮，直至获得清晰的物象后为止，找到最适宜于观察的部位需进一步要观察的部位移视野中央，准备用油镜观察4油镜观察：,（1）上升聚光器，全开虹彩光圈,（2）用粗调节轮提起镜筒或下降载物台，转动转换器将油镜转至镜筒正下方在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油右手顺时针方向慢慢转动粗调节轮使镜筒下降或载物台上升，与此同时，从显微镜的侧面观察使油镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止注意不要压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头3）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节轮将镜筒徐徐上升或将载物台徐徐下降，直到视野内出现物像为止，然后用细调节轮校正焦距如油镜已离开油面而仍未见物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物象看清为止换片,观察完一个标本后，如果想要再观察另一标本时，需先将高倍物镜（或油竟镜）转回到低倍物镜，取出标本，按放片的方法换上新片，即可观察千万不可在高倍物镜（或油竟镜）下换片，以防损坏镜头。

二、显微镜的保养,（1）油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再取一张擦镜纸，滴上少量的二甲苯擦拭，然后再取另一张新擦镜纸将镜头上残留的二甲苯擦净否则粘固透镜的胶质会被二甲苯溶解，日久镜片易移位脱落2）下降聚光器，打开虹彩光圈，使反光镜垂直于镜座，以免积聚灰尘3）用绸布将镜身擦拭干净（切不可用手擦拭），除去灰尘、油污、水汽，以免生锈长霉4）使显微镜的各部件恢复回原位，下降镜筒，使物镜呈“八”字形置于载物台上，然后将显微镜送回镜箱中5）显微镜应存放在干燥阴凉的地方，不要放在强烈的日光下暴晒，霉雨季节应在显微镜箱内放置干燥剂（硅胶），如长时间不用，则光学部分应卸下放在干燥器中，以免受潮生霉6）显微镜应严禁与挥发性药品或腐蚀性药品放在一起，如碘片、盐酸、硫酸等药品三、注意事项,1拿取显微镜必须一只手拿着镜臂，一只手托着镜座，并保持镜身的上下垂直，应避免震动，轻放台上切不可一只手提起，以防显微镜、反光镜功目镜坠落2使用前应将镜身擦拭一遍、用擦镜纸将镜头擦净（切不可用手指擦抹）若遇到镜台或镜头上有干香柏油，可用擦镜纸沾取少量二甲苯将其擦去3使用时如发现显微镜操作不灵活或有损坏，不要擅自拆卸修理，应立即报告指导教师处理。

4注意保护镜头，切不可压碎标本被片，损坏镜头,5显微镜使用完毕，应登记显微镜使用卡经指导教师检查后放回镜箱二、微量吸管使用,（一）目的、原理、实验用品、标本,1、目的：掌握微量吸管的实验方法2、原理：挤压乳胶头使微量吸管产生负压而吸取液体3、实验用品：,一次性微量吸管、带孔乳胶吸头、试管、2ml吸管、NS等4、标本：新鲜抗凝血,（二）操作方法,1、准备吸管 将带孔的乳胶吸头套在微量吸管上，连接处应严密不漏气2、加稀释液 取试管1支，加生理盐水2ml.,3、持管吸血 右手拇指和中指夹住吸管及吸头交接处，示指盖住吸头小孔，三个指头轻微用力，排出适量的气体使管内形成较小的负压，将管尖插入抗凝血，三个指头慢慢松劲，吸取抗凝血到所需刻度后，抬起示指，注意管尖始终不要离开液面，以免吸入气泡，也不要过度用力将血液吸入乳胶吸头4、拭净余血 用干棉球顺微量吸管口拭净余血5、稀释血液 将微量吸管插入含生理盐水的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，再用上清液冲洗管内余血2-3次6、洗涤吸管 依次用蒸馏水洗净，95%乙醇脱水乙醚干燥如为一次性微量吸管，可省略该步骤三）注意事项,1、操作步骤3需反复练习才能准确吸取血液到所需量。

2、一次吸取血液到所需的量，吸管内不能有空节也不能吸取血液过多，最好不要超过所需刻度的2mm.,3、稀释血液前一定要拭净管外余血，释放血液时的动作不能太剧烈，避免破坏血液成分或不能利用上清液将管内血液洗净四）实验评价,微量吸管使用是手工法血细胞分析的第 一步，有很多因素影响检验结果的准确性和精确度，如一次性吸管的质量、操作者的技术熟练程度和责任心等三、改良牛鲍计数板的使用,（一）目的：掌握改良牛鲍计数板结构及使用方法二）原理：一定倍数稀释的血液或体液混匀后滴入具有固定体积和精密划分刻度的改良牛鲍计数板中，在显微镜下对所选择的区域中的细胞进行计数，在乘以稀释倍数，即可换算成单位体积内的细胞数三）、实验用品,1、器材 改良牛鲍计数板、专用盖玻片、光学显微镜、绸布、微量吸管、带孔乳胶吸头、刻度吸管、试管2、试剂 红细胞稀释液,（四）标本：抗凝血,五、操作,1、稀释血液 取试管1支，加红细胞稀释液2ml,加抗凝血10微升，立即混匀，制成红细胞悬液2、准备计数板 用绸布拭净改良牛鲍计数板和专业盖玻片，采用推式法从计数板下缘向前平推盖玻片，将其盖在计数池上3、冲池 用完了吸管吸取制备好的再次混匀的红细胞悬液，沿盖玻片与计数板之间的缝隙冲入计数池。

充液量以恰好充满一侧计数池为宜，不可过多、过少或有气泡，否则需重新操作4、静置 红细胞悬液注入计数池后，静置 2-3分钟待细胞下沉5、显微镜计数 首先在低倍镜下观察整个计数池的结构，同时观察细胞分布是否均匀，如严重不均应重新冲池根据计数不同的血细胞选用不同的放大倍数计数时应遵循一定的路径进行，以免重复或遗漏对压线细胞，依照“数上不数下，数左不数右的原则进行计数附：牛鲍计数板基本结构,血球计数板是一块特制的厚型,载玻片,，载玻片上有四个槽构成三个平台中间的平台较宽，其中间又被一短,横槽,分隔成两半，每个半边上面各刻有一小,方格网,，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

1855 年 发明计数红细胞的计数板,血细胞计数板法是最可靠和最经典计数技术,改良Neubauer,计数板,计数池,Neubauer计数盘,3mm,WBC WBC,WBC WBC,1mm,计算：WBC/L=N/41010,6,20,。