Real-time PCR检测感染宿主血清日本血吸虫DNA水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义（毕业设计-病原生物学专业）.doc

硕士学位论文论文题目 Real-time PCR 检测感染宿主血清日本血吸虫 DNA 水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义研究生姓名指导教师姓名专 业 名 称研 究 方 向论文提交日期官 威夏超明病原生物学感染与核酸分子诊断2013-6-18Real-time PCR 检测感染宿主血清日本血吸虫 DNA 水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义 中文摘要中文摘要第一部分 日本血吸虫 Taqman real-time qPCR 法的建立目的：建立一种灵敏、高效的日本血吸虫 Taqman real-time PCR 定量检测法，并评价其特异性与敏感性方法：以日本血吸虫高度重复基因 SjR2 为靶序列设计引物和 Taqman 探针，收集日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝吸虫、旋毛虫以及肺吸虫成虫，并抽提不同成虫模板，将普通 PCR 扩增的日本血吸虫 SjR2 产物纯化克隆，用 real-time PCR 法进行扩增结果：曼氏血吸虫、肝吸虫、旋毛虫、肺吸虫成虫模板扩增曲线均在阈值水平以下，只有日本血吸虫扩增曲线在阈值线以上，并呈指数状分布将以上各样本扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，只有日本血吸虫泳道出现77 bp特异性目的条带；将日本血吸虫SjR2基因重组质粒连续10倍稀释11个梯度，可检测到质粒最小浓度为4.47×10 copies /μl，其标准曲线回归方程y = -3.0987x + 49.158，相关系数为0.9965。

结论：Taqman real-time PCR 检测法敏感度高、特异性强，具有潜在的应用价值第二部分 Real-time PCR 法对日本血吸虫感染家兔血清 DNA 的定量检测及感染度的评价目的：评价real-time qPCR法应用于日本血吸虫感染宿主血清DNA的早期诊断价值，并探索宿主血清DNA动态变化规律及感染宿主血清DNA 水平与感染度的相关性方法：双性感染家兔模型的建立：分别感染 30、50、100、200 和 500 条日本血吸虫双性尾蚴；单性感染家兔模型的建立：感染日本血吸虫单性尾蚴 200 条收集每只家兔感染后 3d~7w 外周血清，通过 real-time PCR 法检测I中文摘要 Real-time PCR 检测感染宿主血清日本血吸虫 DNA 水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义结果：real-time PCR 法从感染后 3d 的血清模板中即可扩增到阳性产物，其早期检测阈值为 54.36 个拷贝数；在日本血吸虫双性尾蚴感染的模型中，宿主血清DNA 浓度呈上升趋势，且感染 5w 以后血清 DNA 浓度明显升高，特别是感染家兔血清 DNA 水平与感染度呈显著正相关，可用于感染度的评价。

结论：real-time PCR法敏感性高、特异性好，除具有诊断价值外还可以根据检测的阈值，评价宿主感染度，为进一步应用于日本血吸虫病的诊断及疗效考核提供了新的检测方法第三部分 Real-time PCR法对日本血吸虫感染家兔血清DNA 检测用于短期疗效考核的评价目的：探索单、双性感染宿主经吡喹酮治疗后宿主血清 DNA 的动态变化评价real-time qPCR 法应用于日本血吸虫病的短期（6 个月内）疗效考核价值方法：建立分别感染200条双性尾蚴和200条单性尾蚴的家兔模型，感染后7w 、8w先后2次各按150 mg／kg体重的剂量给予每只兔子吡喹酮杀虫治疗(顿服)收集治疗后1d~1w (每天)、2w~23w (每周)外周血清，以real-time PCR 法进行检测结果：在双性感染 200 条尾蚴的家兔模型中，real-time PCR 法从治疗后 1d~1w及 2w~17w 的家兔血清中均能检测到日本血吸虫特异性目的基因，转阴阈值为49.29 拷贝，治疗后一周内宿主血清 DNA 浓度每日检测结果呈逐步上升趋势，治疗一周以后血清 DNA 浓度逐渐下降；在感染 200 条单性尾蚴的家兔模型中，治疗后一周内宿主血清 DNA 浓度同样呈逐步上升趋势，随后 DNA 浓度逐渐下降，并在治疗后第 5w 血清 DNA 的检测结果转为阴性，其转阴阈值为 1784.25 拷贝，与双性感染组治疗后第 9w 检测的血清 DNA 浓度(1846.24 拷贝)相当。

结论：对比单、双性感染组治疗后血清 DNA 定量检测结果显示，双性感染的家兔血清 DNA 在治疗后第 9w 时的浓度为 1846.24 拷贝，与同步单性感染组血清DNA 第 5w 转阴时的阈值（1784.25 拷贝）相当提示此时双性感染宿主血清虫体DNA 已转阴，此时间节点可作为疗效考核时间，而无需等到血清 DNA 完全转阴研究结果表明，real-time PCR 法对日本血吸虫感染宿主血清虫体 DNA 的定量检测IIReal-time PCR 检测感染宿主血清日本血吸虫 DNA 水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义 中文摘要应用于疗效考核，可缩短疗效考核的时间节点更适宜于血吸虫病流行区现场应用第四部分 Real-time PCR法对血清DNA定量检测用于日本血吸虫病人的诊断及感染度的评价目的：评价 real-time PCR 法对日本血吸虫病病人血清 DNA 的检测效果，并探索病人血清 DNA 浓度与其感染度（EPG）的相关性，以证明其潜在的实际应用价值方法：收集 41 例经粪检法、ELISA 和 IHA 血清学检测均呈阳性的日本血吸虫病慢性期病人血清及 30 例粪检法、ELISA 和 IHA 检测均为阴性的健康人血清，用real-time PCR 法进行检测。

结果：41 例病人血清中有 39 例检测结果为阳性，阳性率为 95.1%，30 例正常人血清 DNA 检测结果均为阴性，无假阳性；日本血吸虫病病人血清 DNA 水平与EPG 在总体上呈正相关性结论：real-time PCR 定量检测法灵敏度高、特异性好，不仅可用于血吸虫感染宿主的诊断还可根据血清 DNA 检测阈值评价患者感染度，特别是可根据不同感染度患者经吡喹酮治疗后血清虫体 DNA 转阴阈值作为评价疗效考核的时间节点，而无需等到血清 DNA 完全转阴，可大大宿短疗效考核时间更适宜于流行区现场应用，有望成为血吸虫病短期疗效考核新方法关键词：日本血吸虫；核酸定量检测；Taqman real-time PCR；感染度；短期疗效考核作 者：官 威指导老师：夏超明 教授III英文摘要 Real-time PCR 检测感染宿主血清日本血吸虫 DNA 水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义Real-time PCR for dynamic changes of the serum DNA inhosts infected with S. japonicum and diagnosis andtherapy evaluation of schistosomiasisAbstractPart 1 Establishment of S. japonicum Taqman real-time qPCR assayObjective: To establish a sensitive and efficient S. japonicum Taqman real-timeqPCR assay and evaluate its sensitivity and specificity.Methods: The primers and Taqman probe were based on the sequence of highlyrepetitive retrotransposon SjR2. S. japonicum, S. mansoni, C. sinensis, T. spiralis,Paragonimus worms were collected and extracted. The products of SjR2 amplified withconventional PCR were purified and cloned to standard plasmid, and amplified byreal-time PCR.Results: The amplification curve was only observed in the samples of S.japonicum with exponential distribution, S. mansoni, C. sinensis, T.spiralis andParagonimus below thresholds; Visualization of real-time PCR products on 2% agarosegel also verified the amplification of the S. japonicum specific target of expected size(77bp). The minimum amount of the recombinant plasmid clones of SjR2 of S.japonicum detectable using the real-time PCR assay was 44.7 copies. The coefficient ofdetermination (R2) was 0.9965 and regression equations is y = -3.0987x + 49.158.Conclusion: Taqman real-time PCR assay was sensitive and specific with potentialapplied value.Part 2 Real-time PCR assay for quantitive detection of serum DNA inhosts infected with S. japonicum and evaluation of infectiosityObjective: To evaluate the value of early diagnosis for serum DNA of hostsinfected with S. japonicum by real-time PCR, and explore the dymanic change rules ofserum DNA in hosts and the correlations between DNA level and infectiosity.IVReal-time PCR 检测感染宿主血清日本血吸虫 DNA 水平动态变化及其在血吸虫病诊断和疗效考核中的意义 英文摘要Methods: Establishment of rabbits model infected with mixed sexual cercariae:infected with 30, 50, 100, 200 and 500 dual sexual cercariae of S. japonicum,respectively; Establishment of rabbits model infected with single sexual cercariae:infected with 200 single sexual cercariae of S. japonicum. The peripheral sera werecollected from 3rd day to 7th week post-infection and detected by real-time PCR.Results: Positive products were amplified 。