南开大学实用核磁技术 lecture 7---NOESY.ppt

Nuclear Overhauser Offect (NOE)Nuclear Overhauser Offect (NOE)Albert W. Overhauser顺反构型顺反构型立体构型立体构型芳香环的指定芳香环的指定 当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相互影响－－偶极作用相互影响NOENOE反应原子核自旋之间通过空间的偶极－偶极相互作用反应原子核自旋之间通过空间的偶极－偶极相互作用; ;如果两个如果两个1 1H H核间的距离小于核间的距离小于5 5Å Å，那么在，那么在NMRNMR谱中就可以观察到谱中就可以观察到NOENOE信号信号 ( (在蛋白质中也可观察到小于或等于在蛋白质中也可观察到小于或等于6 6Å Å的的NOENOE信号信号 ) ) I∝1/I∝1/d dijij6 6 I I –– 两个两个1 1H H核间的核间的NOENOE信号强度信号强度 d dijij –– 两个两个1 1H H核间的空间距离核间的空间距离Nuclear Overhauser Offect (NOE)Nuclear Overhauser Offect (NOE)当两个核当两个核AXAX在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相互影响。

选择作用相互影响选择A A的频率照射，会影响的频率照射，会影响X X的能级分布，的能级分布，从而改变其信号强度从而改变其信号强度Nuclear Overhauser Offect (NOE)a a a aa a a ab b b bb b b ba a a ab b b bb b b ba a a aX X1 1X X2 2A A2 2A A1 1WW2 2WW0 0单量子数驰豫单量子数驰豫W1不产生不产生NOE效应双量子数驰豫双量子数驰豫W2和零量子数驰豫和零量子数驰豫W0产生产生NOE效应小分子小分子运动速度快，采取运动速度快，采取W2方式：方式：能级能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量也会增加上的分布数量也会增加上的分布数量也会增加上的分布数量也会增加正向正向正向正向NOENOE效应效应效应效应大分子大分子运动速度慢，采取运动速度慢，采取W0方式：方式：能级能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量也会增加。

上的分布数量也会增加上的分布数量也会增加上的分布数量也会增加反向反向反向反向NOENOE效应效应效应效应Nuclear Overhauser Offect (NOE)当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极－－偶极作用相互影响NOENOE有正负有正负, ,小分子一般有正向的小分子一般有正向的NOE,NOE,大分子有反向大分子有反向的的NOE.NOE.Nuclear Overhauser Offect (NOE)影响影响NOENOE大小的因素：大小的因素：核共振频率核共振频率v v0 0分子在溶剂中的移动性能分子在溶剂中的移动性能t tc c核间的空间距离，核间的空间距离，r r－－6 6{ {Me –cis} => +19%Me –cis} => +19%{ {Me –trans} => -2%Me –trans} => -2%{ {Ha} => +45%Ha} => +45%1D NOE优点：时间短，结果直接优点：时间短，结果直接 可定量可定量缺点：需要分别激发，无法一次得到全部结果缺点：需要分别激发，无法一次得到全部结果 需要对需要对NOENOE有估计有估计1D NOE1D NOE13------15a, 12, 1415a-----15b, 14, 162D NOESY2D NOESY2D NOESY2D NOESY2D NOESY8 - 7, 127 - 18, 18'3 - 5, 105 - 11, 16, 18'9 - 10, 17, 17'10 - 1611 - 18, 16, 14, 18'18 - 13, 18'16 - 14, 1713 - 14, 17, 17'13' - 17, 17'17 - 17'2D NOESY2D NOESY2D NOESYTOCSY (solid lines) and NOESY (dotted lines) AVANCE 900 2.0 mM Lysozyme NOESYNOENOE实验对环境变化非常敏感，为了得到高质量的谱图，实验对环境变化非常敏感，为了得到高质量的谱图，有如下建议有如下建议1 1））高质量的样品高质量的样品。

样品的分子量最好小于样品的分子量最好小于800800或者大于或者大于20002000不然NOENOE信号会很小在这种条件下，最好做信号会很小在这种条件下，最好做ROEROE实实验2 2））样品稳定性好样品稳定性好3 3））高质量的核磁管高质量的核磁管4 4））最好预先超声或者通氩气除氧最好预先超声或者通氩气除氧5 5））NOENOE实验过程中最好做到恒温实验过程中最好做到恒温Nuclear Overhauser Offect (NOE)Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy （（ROSEY））ROESYROESY可以理解为旋转坐标系中的可以理解为旋转坐标系中的NOE,NOE,由于实验室坐标系中的交叉弛由于实验室坐标系中的交叉弛豫速率在小分子为正，在大分子为豫速率在小分子为正，在大分子为负，在中间大小的分子负，在中间大小的分子( (分子量分子量10001000～～3000)3000)，如小肽接近零，因，如小肽接近零，因此中间大小的分子此中间大小的分子NOENOE交叉峰非常交叉峰非常弱乃至消失弱乃至消失, ,这时可以用这时可以用ROESYROESY得到得到距离信息距离信息. .但是但是ROESYROESY实验受频偏等实验受频偏等因素影响大，而且有一部分反映了因素影响大，而且有一部分反映了耦合关系耦合关系, ,难以定量，解析时需要难以定量，解析时需要小心。

小心ROSEY与与NOESYNOESY的区别：的区别： 1 1）分子量在）分子量在 1000-30001000-3000范围，建议使用范围，建议使用 ROESYROESY；小于；小于10001000和大于和大于30003000的化合物宜做的化合物宜做NOESYNOESY2 2））NOESY NOESY 是相敏图是相敏图, , 在对角峰附近的分辨率较差；在对角峰附近的分辨率较差；3 3））ROESY ROESY 得到的都是吸收谱，得到的都是吸收谱， 因此有相信号点因此有相信号点 ( (交叉交叉峰峰) ) 距离对角峰近的可以考虑使用距离对角峰近的可以考虑使用 ROESYROESYROSEYROSEYTime Dependence of NOE - Mixing TimesNOE dynamically builds up and then decays due to relaxation during the mixing time1) small molecules 0.5 -1 sec. Start with 0.5 sec.2) medium size molecules 0.1 -0.5 sec. Start with 0.25 sec.3) large molecules 0.05 - 0.2 sec. Start with 0.1 sec.同一分子中不同的同一分子中不同的NOENOE关关系系, ,其混合时间略有不同其混合时间略有不同. .如果要得到完美的如果要得到完美的NOENOE谱谱, ,需要采用不同的混合时间需要采用不同的混合时间做一系列谱做一系列谱. .一般情况下一般情况下选择选择0.3 -0.5 sec.0.3 -0.5 sec.关于关于NOENOE的几点注意的几点注意1 1、为测定、为测定NOENOE，需要对样品的核磁谱图有准确的指认。

最常用的是同核，需要对样品的核磁谱图有准确的指认最常用的是同核NOENOE，故，故需要指认好氢谱需要指认好氢谱 2 2、、NOENOE的测定有一维谱和二维谱两大类一维谱是作的测定有一维谱和二维谱两大类一维谱是作NOENOE的差谱二维谱的方式的差谱二维谱的方式即测即测NOESYNOESY或或ROESYROESY3 3、、NOENOE的具体数值除和研究的分子密切相关外，也和仪器（工作频率）、实验条的具体数值除和研究的分子密切相关外，也和仪器（工作频率）、实验条件等有关，因而准确性和相互可比性不够好件等有关，因而准确性和相互可比性不够好4 4、、NOENOE信息的价值与两个相关的磁性核跨越的化学键的数目有关当两核越是跨信息的价值与两个相关的磁性核跨越的化学键的数目有关当两核越是跨越了多根化学键还显示越了多根化学键还显示NOENOE时，这越能排除相对多的构型、构象可能性，因而较时，这越能排除相对多的构型、构象可能性，因而较重要的立体化学信息重要的立体化学信息5 5、在应用、在应用NOENOE时，常有某些预定的分子模型，根据时，常有某些预定的分子模型，根据NOENOE的结果可以从中作出明确的结果可以从中作出明确的抉择。

的抉择关于关于NOENOE的几点注意的几点注意6 6、、NOENOE最适合刚性分子在这种情况下，核组之间具有确定的距离最适合刚性分子在这种情况下，核组之间具有确定的距离7 7、若样品为柔性分子，相对于核磁共振的时标，分子在溶液中存在较快的构、若样品为柔性分子，相对于核磁共振的时标，分子在溶液中存在较快的构象互变，象互变，NOENOE测定的是一个平均结果，因而无法得到具体的构象信息此时可测定的是一个平均结果，因而无法得到具体的构象信息此时可以考虑下列方法：以考虑下列方法：1 1）作变温实验，使体系温度降低，如果样品在溶液中有优势构象，可能得到）作变温实验，使体系温度降低，如果样品在溶液中有优势构象，可能得到NOENOE结果2 2）加入使溶液变稠的物质，如）加入使溶液变稠的物质，如SDS(SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠) )，使得构象转换的速率，使得构象转换的速率降低3 3）将样品分子作化学修饰，即将其结构稍加变化以便测定）将样品分子作化学修饰，即将其结构稍加变化以便测定NOENOE其它种类的二维核磁其它种类的二维核磁HOHAHAHOHAHA（（同核全相关谱）同核全相关谱）: :测定样品分子中所有偶合质子关系的化学位移相关谱。

测定样品分子中所有偶合质子关系的化学位移相关谱GHSQCGHSQC（（检测检测1 1H H的梯度增益异核单量子相关谱）的梯度增益异核单量子相关谱）测定样品分子中，碳氢的直接相连关系测定样品分子中，碳氢的直接相连关系COLOCCOLOC（（检测检测1 1H H的异核远程相关谱）的异核远程相关谱）测定样品分子中，中远程碳氢相关关系测定样品分子中，中远程碳氢相关关系INADEQUATEINADEQUATE（（低丰度核双量子跃迁实验）低丰度核双量子跃迁实验）测定样品分子中，低丰度核的相关关系测定样品分子中，低丰度核的相关关系常见核磁原子核的化学位移范围常见核磁原子核的化学位移范围1 1H H TMS TMS 0-150-151313C C TMS TMS 0-2200-2201515N N NHNH3 3（（l l）） 0-9000-9001717O O H H2 2O O -50-1700-50-17001919F F CFClCFCl3 3 - -280-250280-2502929Si Si TMS TMS -380-80-380-803131P P 8585％％H H3 3POPO4 4 - -480-270480-2701414N and N and 1515N NMRN NMR1515N N能够产生很尖锐的核磁信号，但灵敏度很低。

能够产生很尖锐的核磁信号，但灵敏度很低1414N N灵敏度相对较高但核磁信号峰非常宽，以至于在很多情况下无法分析灵敏度相对较高但核磁信号峰非常宽，以至于在很多情况下无法分析1414N and N and 1515N NMRN NMR1414N NMRN NMRI=1Natural abundance 99.63%Reference compound NH3 liquidReceptivity rel. to 1H at natural abundance 1.01 × 10-3Receptivity rel. to 13C at natural abundance 5.7414N NMR1414N N的高对称性小分子的信号宽度一般在几十或几十赫兹的范围内，而不对称的的高对称性小分子的信号宽度一般在几十或几十赫兹的范围内，而不对称的大分子的峰宽可能达到大分子的峰宽可能达到10001000赫兹上下因此一般用来区分很小的分子和赫兹上下因此一般用来区分很小的分子和N N2 2 15N NMR1515N N的灵敏度非常低，但可以得到尖锐的信号。

的灵敏度非常低，但可以得到尖锐的信号一般使用很大浓度的溶液或同位素标定的化合物进行研究一般使用很大浓度的溶液或同位素标定的化合物进行研究驰豫时间一般很长（几十秒），需要长的驰豫时间一般很长（几十秒），需要长的d1d1，或添加驰豫试剂，或添加驰豫试剂 I=1/2Natural abundance 0.37%Reference compound 90% CH3NO2 in CDCl3 or liquid NH3Receptivity rel. to 1H at natural abundance 3.85 × 10-6Receptivity rel. to 13C at natural abundance 0.021915N NMR15N NMR spectrum of sodium azide (1M) in D2O15N NMR spectrum of enriched HIV-1 protease276.9N2–HN3243.1N1H–O245.3N3H231P NMRI=1/2Natural abundance 100%Reference compound 85% H3PO4 in H2O = 0 ppmReceptivity rel. to 1H at natural abundance 6.67 × 10-3Receptivity rel. to 13C at natural abundance 37.7化学位移值交叉，规律性不强，化学位移值交叉，规律性不强，要多查阅文献数据。

要多查阅文献数据PBu3 -32.5 ppmPiBu3 -45.3 ppmPsBu3 7.9 ppmPtBu3 63 ppm31P NMR与质子的耦合使峰变宽与质子的耦合使峰变宽 一键耦合常数为一键耦合常数为200-700Hz200-700Hz，，二键耦合常数为二键耦合常数为0.5-20Hz0.5-20Hz 29Si NMRI=1/2Natural abundance 4.68%Receptivity rel. to 1H at natural abundance 3.68 × 10-4Receptivity rel. to 13C at natural abundance 2.1629Si NMRTMSSiHCl3 一键耦合常数一般在几百赫兹的级一键耦合常数一般在几百赫兹的级别上二键耦合常数为别上二键耦合常数为6.6Hz6.6Hz 29Si-NMR spectrum of TMS in CDCl319F NMRI=1/2Natural abundance 100%Reference compound CFCl3 = 0 ppm，， CF3COOH = -78.5 ppmReceptivity rel. to 1H at natural abundance 0.83Receptivity rel. to 13C at natural abundance 471619F NMR金属有机核磁金属有机核磁OrganolithiumOrganolithium6Li : Q=8.0*10-4a=7.4%I=1 6Li : Higher resolution7Li : Q=4.5*10-2a=92.6% I=3/2 7Li : Higher sensitivityRef: 1M or 0.1M LiCl in D2O金属有机核磁金属有机核磁Boron10B : Q= 8.5 * 10-2 a=19.6% I=311B : Q= 4.1 * 10-2a=80.4% I=3/2 11B : Higher sensitivityRef: Et2O·BF3 金属有机核磁金属有机核磁1111B coupling B coupling 10101010B : Q= 8.5 * 10B : Q= 8.5 * 10-2 -2 a=19.6%a=19.6% n n n n=10.7=10.7 I=3 I=32 2nI+1 = 7nI+1 = 72 2nI+1 = 4nI+1 = 411111111B : Q= 4.1 * 10B : Q= 4.1 * 10-2-2a=80.4%a=80.4% n n n n=32.1 I=3/2=32.1 I=3/2NaB BF F4 4 / D2O1919F-NMRF-NMR11111111B BF F4 41010B BF F4 4J JBFBF=0.5 Hz=0.5 HzJ JBFBF=1.4 Hz=1.4 Hz。