用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应.doc

1用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体 转染树突状细胞诱导细胞毒 T 细胞抗淋 巴瘤免疫效应作者：朱雄鹏，陈志哲，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书【摘要】 本研究探讨转染 survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应对人外周血 DC 进行诱导培养，以 Ad SVV 转染 DC，用 Western blot 鉴定 Survivin 的表达，用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）反应，用混合淋巴细胞反应（MLR）测定 DC 刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，以 ELISA 法检测上清中的细胞因子 IL 12 含量结果表明：在MLR 中，刺激应答比（S/R）为 1∶5、1∶10、1∶50 和 1∶100 时，转染 Ad SVV 的 DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；转染 Ad SVV 的 DC 组所诱发的CTL 活性明显高于对照 DC 组；转染病毒后第 2 天，转染 Ad SVV 的 DC 组的IL 12 分泌水平高于对照 DC 组结论：含存活蛋白基因的 DC 能够在体外诱导特异性 CTL 效应，对 CA46 细胞有明显的杀伤作用。

【关键词】 survivin 基因 树突状细胞 CA46 细胞系 淋巴瘤 细胞毒性 T 细胞 免疫治疗Induction of Anti lymphoma Cytotoxic T Cell Effect by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Vectors Carrying Survivin GeneAbstract This study was purposed to investigate the immunological effects of modified dendritic cells (DCs) in inducing cytotoxic T cells (CTLs) effect against lymphoma cells. The DCs were derived from human peripheral blood and transfected with recombined adenovirus vector carrying survivin gene, Western blot was used to 2detect the expression of survivin, the lactate dehydrogenase (LDH) release test was used to determine the cytotoxicity of CTLs, the mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to measure the ability to proleferate allo lymphocyte by DCs, ELISA was used to assay IL 12 level in supernatant. The results showed that the expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. In MLR assay, DCs transfected with Ad survivin could induce higher allogeneic lymphocytes reaction at the ratios of 1∶5,1∶10,1∶50 and 1∶100. DCs transfected with Ad survivin had much higher activity of CTL to CA46 cells than control DCs. The levels of IL 12 of supernatants containing DCs transfected with Ad survivin were significantly higher than that in the control group. It is concluded that DCs transfected with Ad survivin can induce CTL response in vitro against lymphoma cells.Key words survivin gene； dendritic cell； CA46 cell line; lymphoma; cytotoxic T cell; immunotherapy树突状细胞(dendritic cell, DC)作为机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，在激活 T 细胞介导的免疫反应中起关键性作用，而 survivin（存活蛋白，SVV）基因是肿瘤组织较为特异的基因，其编码的蛋白 survivin 成为肿瘤较理想的靶抗原之一。

因此，我们以重组腺病毒介导 SVV 基因修饰 DC，观察诱导产生的特异性抗淋巴瘤免疫效应，为以 DC 为基础肿瘤免疫治疗提供实验依据材料和方法材料表达 survivin 蛋白的重组腺病毒（Ad SVV）由本所构建、包装［1］，滴度为： Ad SVV 2.65×109pfu/ml；恶性淋巴瘤细胞株 CA46 为本室保存株总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国 Pierce 公司产品；兔抗人 survivin 多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔 IgG、Western blotting lunimol 试剂（ECL）为Santa Cruz 公司产品Cytotox96 Non Radioactive Cytotoxicity Assay 试剂盒购自Promega 公司细胞因子 IL 12 检测试剂盒购自深圳晶美生物公司中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)转染存活蛋白基因的树突状细胞3抗淋巴瘤免疫的研究 DC 的分离、培养和病毒感染人外周血 DC 的分离和培养参照文献［1］，收集培养第 7 天的 DC，按 MOI 为100 加入重组腺病毒，分为 3 组： 转染 Ad SVV 的 DC 组(Ad SVV DC)、空载体转染 DC 组（Ad CMV DC）和未转染 DC 组（N DC），并补充生长因子GM CSF、IL 4（终浓度均为 1 000 U/ml）。

于 37℃ 5% CO2，培养箱继续培养 48小时 (第 9 天)收集细胞Survivin 蛋白表达的 Western blot 鉴定收集第 9 天转染 Ad SVV 的 DC 组和空载体转染 DC 组的 DC，进行蛋白质抽提，SDS PAGE 电泳，Western blot 鉴定外源基因 SVV 蛋白的表达［1］同种混合淋巴细胞反应(MLR)测定取培养第 9 天的 Ad SVV DC 和 N DC，分别加入丝裂霉素 C，使其终浓度为50 μg/ml，在 37℃，5% CO2 的培养箱中培养 45 分钟，作为刺激细胞分别以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔将 DC 加入 96 孔板中，以 T 淋巴细胞供者自身的 PBMC 为对照组，每组设 3 个复孔每孔均加入 1×105 的 T 淋巴细胞，刺激反应细胞之比（S/R）分别为 1∶5，1∶10，1∶50，和 1∶100，终体积 200 μl，于 37℃，5% CO2 的培养箱中培养 96 小时终止培养前 4 小时加入 MTT 20 μl（5 mg/ml），培养终止后加 DMSO 200 μl，充分混匀后静置选择波长为 570 nm 处测 OD570值。

计算刺激指数（SI），结果以 3 孔的均值表示刺激指数（SI）=实验孔 OD 均值/对照孔 OD 均值4CTL 细胞体外杀伤活性的检测效应细胞的制备 取培养第 9 天的 Ad SVV DC 组细胞和 N DC 组细胞各5×105，作为刺激细胞，加入到 24 孔培养板中，按 5×106/孔加入经 T 细胞尼龙毛柱分离的 T 淋巴细胞（反应细胞）；同时以不与 DC 共孵育的自体淋巴细胞为对照，每组设 3 个复孔加入 IL 2（500 U/ml），于 37℃、5% CO2 的培养箱培养以后隔天半量换液，并补充 IL 2，继续培养至第 14 天，作为效应细胞CTL 的活性测定 以 1×104∕孔加靶细胞（CA46）到 96 孔板中，再分别按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）加效应细胞到各孔中，每组设 3 个复孔同时设 4 个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按Cytotox96 Non Radioactive Cytotoxicity Assay 试剂盒说明书检测 CTL 反应，以对靶细胞的杀伤率表示 CTL 活性细胞杀伤率(%)= ［（实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）］×100%细胞因子的检测收集培养 Ad SVV DC 以及 N DC 的当天、第 2 天、第 4 天上清，按试剂盒说明书方法进行 IL 12 含量检测。

统计学处理本实验数据应用 SPSS 11.5 统计软件进行方差分析 结 果5存活蛋白的表达经 Western blot 检测，转染 Ad SVV 的 DC 在 16.5 kD 处可见一阳性条带（附图），提示经基因转导的 DC 可有效表达 SVV 蛋白，而未转导基因的 DC 未检出 SVV蛋白表达Figure . Expression of SVV protein detected by Western blot. M: marker. Lane 1: Ad CMV transfected DC. Lane 2: Ad SVV transfected DC.刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力在不同的 S/R（刺激细胞/应答细胞为 1∶5、1∶10、1∶50、1∶100）比值时，转染Ad SVV 的 DC 与未转染的 DC 比较，具有更强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力（P0.01）CTL 杀伤活性的检测在效靶比（E/T）为 5∶1、10∶1 和 20∶1 时，转染 Ad SVV 的 DC（Ad SVV DC）所诱发的 CTL 活性均值分别为 23.48％、38.24％和 46.76%，未转染的 DC（N DC组）诱发的 CTL 活性为 7.32%、8.83%、14.72%，两组间的 CTL 活性有显著性差异（P0.05）。

对照组在 E/T 为 5∶1、10∶1 和 20∶1 时未检测到 CTL 活性细胞因子的检测在转染病毒后第 2 天、第 4 天，Ad SVV DC 组和 N DC 组的 IL 12 分泌水平分别为 50.7±3.2 pg/ml 和 56.4±2.7 pg/ml 及 36.5±1.8 pg/ml 和 42.3±2.6 pg/mlAd SVV DC 组的 IL 12 分泌水平高于 N DC（P0.05）对照组上清中未能检测到 IL 126讨 论非霍奇金淋巴瘤（NHL）的发病率及死亡率均有上升趋势，传统治疗难以彻底消灭肿瘤细胞，因此如何进一步提高疗效并最终根治本病，已成为目前研究的热点和难点近年来，对树突状细胞在肿瘤抗原呈递和肿瘤免疫中重要作用的揭示, 开拓了肿瘤免疫治疗的又一新领域肿瘤疫苗即肿瘤的特异性主动免疫治疗，近年来取得了可喜进展，其中尤以 DC 疫苗的进展最为瞩目［2,3］Survivin 基因是一个抗凋亡基因,它在大多数肿瘤组织中表达，而在正常成人组织中不表达业已证明，HL 60、K562、CA46、U266 等血液肿瘤细胞系均高表达survivin［4，5］因此，应用靶。