利用电化学聚合固定抗体的电化学发光免疫分析法检测人免疫球蛋白.doc

利用电化学聚合固定抗体的电化学发光免疫分析法检测人免疫球蛋白　　【摘要】基于电化学聚合在金电极外表固定兔抗人免疫球蛋白g抗体与人免疫球蛋白g及标记有ru(bpy)2+3的羊抗人免疫球蛋白g抗体之间发生特异性免疫反响，形成三明治构造，成功建立了用于测定人血清中免疫球蛋白g的电化学发光(el)免疫技术利用此方法测定人免疫球蛋白g含量，浓度在50μg/l～2g/l范围内与电化学发光强度呈良好的线性关系，线性回归方程为y(a.u.)=48.41+0.09x(μg/l)(n=7)；检出限为20μg/l(3σ)测得正常人血清中免疫球蛋白g平均含量为11.2g/l，结果令人满意　　【关键词】人免疫球蛋白g电化学发光免疫检测电化学聚合　　1引言　　免疫检测法具有快速、灵敏、选择性好等特点，被广泛应用于临床诊断、法医学、药物学和环境科学等研究领域[1～６]特别是近年来，随着对免疫传感器的深化研究，开展了多种检测技术，包括电化学、光学、压电检测、放射免疫分析法和电化学发光检测法等[７～1２]其中，放射免疫分析法涉及环境污染问题，酶免疫分析法受到酶保存和检测灵敏度的限制；荧光免疫法有光的散射和杂光的干扰等问题，限制了其在免疫方面的应用。

电化学发光是一种由于电化学反响引起化学发光的现象，具有操作简便、背景信号低、易于控制、特异性高等特点ru(bpy)2+3化合物在电化学发光中是一种应用最为广泛的发光物质，由于它具有灵敏度高，稳定性好，发光效率高等特点，所以被广泛用于实际生物样品的分析检测[1３,1４]　　免疫球蛋白(igg)是人体血清中含量最高的抗感染抗体，约占血清免疫蛋白的70%～80%，其含量的上下往往作为慢性感染、慢性肝并免疫性疾病等疾病的参考值，所以对其含量检测意义重大现有igg检测方法有压电免疫传感器技术[1５]、酶免疫法[1６]和荧光免疫法[1７]等　　对于生物传感器，生物分子固定的数量和活性是非常重要的，直接影响传感器的性能传统的固定方法，如硅片上的硅烷化固定技术、金电极外表的巯基自组装法以及戊二醛等化学试剂组装法等，操作复杂，组装时间长，难以保持生物分子的活性采用吡咯和生物分子共聚的方法，不但操作简便、耗时少、易于控制，还能适用于微电极及微量试剂的选择性固定这种方法常用于酶传感器、安培传感器及电位传感器，应用于电化学发光免疫传感器却少有报道本研究采用聚合吡咯和抗体的方法将抗体固定到金电极外表通过三明治免疫结合法实现对人igg的电化学发光免疫检测，结果令人满意。

　　2实验局部　　2.1仪器与试剂　　2.2实验方法　　２．２．２电化学聚合吡咯固定抗体将金电极在金相砂纸上抛光后置于无水乙醇和蒸馏水中分别超声清洗5in，于－1.0～+1.0v电位下在0.1l/lh2s4溶液中循环扫描20in，取出后用蒸馏水冲洗干净，将新颖处理好的电极浸入含有0.1l/l吡咯、0.1g/l兔抗人igg、0.1l/lkl的0.1l/l磷酸盐缓冲溶液(ph7.2)中，在800v的电压下聚合200s，取出用蒸馏水冲洗干净　　２．２．３免疫组装和电化学发光检测将1%bsa滴加到修饰有抗体的电极外表作用20in后，再滴加10μl人igg溶液到电极外表组装2h，最后将标记有ru(bpy)２＋3的羊抗人igg与电极组装2h后，完成电极的免疫组装　　以铂丝为对电极，ag/agl电极(3.0l/lkl)为参比电极，组装好的电极为工作电极，自制的石英皿为检测池，注入发光检测液，在工作电极上施加从0.45～1.2v的循环电压，检测工作电极上的el信号　　3结果与讨论　　3.1电极修饰过程表征和ru(bpy)2+3标记羊抗人抗体的电化学性质　　为了保持抗体的生物活性，应选择在中性条件下聚合吡咯。

对聚合过程进展了阻抗表征，由阻抗图谱(图1)可知，吡咯聚合后阻抗值增大，这是因为在中性条件下吡咯聚合后其电化学活性降低，与文献[19]报道吡咯在ph＞5条件下聚合后电子传导才能下降，导电性变差一致而在共聚吡咯和抗体时由于抗体对电子传递的阻碍作用，使其阻抗值明显大于单聚吡咯的阻抗值随着每一步组装，阻抗值都明显增大，分别为2974ω(人igg)和4980ω(ru(bpy)2+3标记羊抗人igg)　　图1经过不同修饰的金电极在0.01l/lk3[fe(n)6]/k4[fe(n)6]中的阻抗图〔略〕　　fig.1eisfrthedifferentgldeletrdeseasuredin0.01l/lk3[fe(n)6]/k4[fe(n)6]　　频率(frequeny):1～1×105hz如图２所示，ru(bpy)2+3标记的羊抗人igg(b)在1.1v附近有明显的氧化峰与ru(bpy)2+3(a)的电化学性质一致[20]；在tpra存在条件下，在1.17v附近有明显的发光信号(b)如图3，与未标记抗体的ru(bpy)2+3发光信号(a)相似，说明ru(bpy)2+3标记到羊抗人igg上后其电化学性质和电化学发光性质并没有发生改变。

而未标记ru(bpy)2+3的抗体在0.45～1.2v没有明显发光信号　　电压〔ptential〕：0.45～1.2vvs.ag/agl；扫速〔sanrate〕：100v/s　　电压〔ptential〕：0.45～1.2vvs.ag/agl；扫速〔sanrate〕：100v/s　　3.2实验条件的优化　　3.2.1电化学聚合时间对el的影响文献[21]采用800v恒电位聚合吡咯(0.1l/l)，聚合时间直接影响到聚吡咯的厚度和抗体的固定量如图4所示随着聚合时间的增加，el强度明显增强；200～300s时el强度根本上处于平台；但是当聚合时间大于300s后，el强度开场逐渐降低根据文献[22]，ru(bpy)2+3的发光机理如下：　　tpra－etpra·+　　tpra·+tpra·+h+　　tpra·+ru(bpy)２＋3＋ru(bpy)＋3+prdut　　ru(bpy)＋3+tpra·+ru(bpy)２＋3*+prdut　　tpra氧化产物tpra·+与ru(bpy)＋3反响生成ru(bpy)２＋3*,ru(bpy)２＋3*再由激发态返回基态ru(bpy)2+3时以光的形式放出能量因此tpra的氧化对el强度有着重要的影响。

　　图4聚合时间对el强度的影响〔略〕　　fig.4effetsfplyerizatintienelintensity　　电压(ptential)：0.45～1.2vvs.ag/agl；扫速(sanrate)：100v/s所以随着聚合时间的增加，聚吡咯层变厚，导电性变差，tpra在电极外表氧化难度增加，因此导致el强度下降　　本实验选择聚合时间为２００s　　3.2.2免疫结合时间对el的影响由于羊抗人igg和人igg结合时间与兔抗人igg与人igg结合时间相近，实验中采用的两组免疫结合时间一样，考察了结合时间从10in到4h中el值实验结果说明：在室温下当免疫时间从10in到2h，el值逐渐增加；当免疫时间大于2h，el值到达一个平台根本保持不变，这说明抗原抗体之间的特异性结合根本完成，因此实验选择免疫结合时间为2h　　图5ph值对el强度的影响〔略〕　　fig.5effetsfphvaluefdetetingbufferslutinnelintensity　　电压(ptential)：0.45～1.2vvs.ag/agl；扫速(sanrate)：100v/s　　3.2.3发光检测液的优化根据文献报道，三丙胺的存在能极大地增强ru(bpy)2+3的el强度，l－４能抑制金电极外表自身氧化，增加el强度[2３]。

另外发光检测液的ph值对ru(bpy)2+3的el强度亦有很大的影响由图5可以看出，ph8.5时el强度随着ph值增加而迅速增加；当ph8.5～9.2时el强度到达一个平台，ph9.2时el强度迅速下降　　实验选择检测液的最正确条件为1.0×10－3l/l三丙胺(tpra)＋5.0×10－3l/llil4＋2.0×10－2l/l磷酸盐缓冲溶液(ph8.7)　　3.3igg的检测　　3.3.1igg的线性范围及检出限在最正确检测条件下，进展了igg浓度检测，结果如图6所示igg浓度在50μg/l～2g/l范围内与el强度呈良好线性关系，其回归方程为y(el强度a.u.)=48.41+0.09x(igg浓度μg/l)(n=7)，相关系数为0.996，检出限为20μg/l(3σ)与文献[13]方法比拟，该方法具有更高的灵敏度，检出限降低1个数量级　　图6不同浓度igg与el强度关系图〔略〕　　fig.6rrelatinbeteeniggnertratinfr50μg/lt10g/lvs.theelintensity.insert:thenentratinfiggasfr50μg/lt2g/lvs.elintensity　　电压〔ptential〕：0.45～1.2vvs.ag/agl；扫速〔sanrate〕：100v/s。

　　３．３．２实际血样中igg的检测取正常人血清，用pbs缓冲溶液稀释，按照上述测试方法测定igg含量，同时参加标样作加标回收率实验，实验结果见表1实验结果说明：实际血样中人血清igg测量值分别为13.0、10.0和10.5g/l，加标回收率分别为92％、90％和106％，均在正常人血清人igg含量(8～14g/l)[14]范围之内回收率实验亦说明本方法可行　　表1人血清中igg浓度检测结果〔略〕　　table1ｒesultsfigginhuanseruusingtheelbisensr　　４结论　　介绍了一种新型检测人igg的免疫方法，用电化学聚吡咯固定生物分子免疫组装后进展el检测实验操作简单，耗时少，固定效率高，易于控制此检测方法不但能用于人igg的检测，还能应用于其它抗原抗体的免疫检测、dna检测以及免疫药物的筛眩此技术将有望用于多种抗原抗体的同时检测和免疫芯片的研制　　【参考文献】　　１sithd.anal.he.,2002,74(17):462a～466a　　２hristdulidesn,tran,flrianpn,rdriguez,gdeya,ali,neikirkd,devittj.anal.he.,2002,74(13):3030～3036　　３ksukes,hirshi,hisashiy,shinbus,atsuu,hirshia,yasu.j.agri.fdhe.,2022,55(23):9345～9350　　5lisl,ihinseh,shindat,uedah.anal.he.,2022,79(16):6193～6200　　6inj,baeuneraj.anal.bihe.,2002,303(2):186～193　　7apbelln,del,dyeart,hellera.fresenius′j.anal.he.,1999,364(1／2):165～169　　8ribhj,haesaj,farlandad,ranjity,vanduynerp.j.phys.he.b,2022,107(8):1772～1780　　10luh,henh,linys,linj.bitehnlgyprgress,2000,16(1):116～124　　１２angj,liug,engelhardh,linyｈ.anal.he.,2022,78(19):6974～6979　　１３angxy,zhuj,yun,xiass,hangz,hepg,fangyz.anal.hi.ata,2022,598(2):242～248　　１４zhan,bardaj.anal.he.,。