曲线测试实验流程.doc

IC50曲线的测定IC50即半抑制率， 标准曲线是一个S型曲线IC50为50%卬制浓度即细胞存活量为对 照样本一半时所对应的浓度，半数抑制越低，说明药物对细胞的毒性越高实验操作步骤如下:1. 细胞准备:A. 细胞状态检测：从培养箱中取出细胞，显微镜下观察状态描述：观察结果，细胞汇合度：B. 细胞处理：将细胞培养基吸出后，加入 2ml PBS缓冲液洗一次，加入1ml 0.25% Trypsin-EDTA， 放入培养箱中静置数分钟，直至细胞完全离壁悬浮，加入5ml含10%FBS勺培养基（无 抗生素）终止酶活，混匀后液体转移至15ml离心管，1000rpm离心3min,弃去液体C. 细胞计数：于15ml离心管中加入1ml含10%FBS勺培养基（无抗生素），充分混匀取40ul计 数，公式如下：细胞浓度（数/ml ） = （4大方格细胞数之和/4 ）x 10 将稀释好的细胞用排枪加至96 / 384孔板：置于培养箱37C 5%CO2条件下培养24小时，待细胞贴壁后加药 药物稀释：将药物进行3倍倍比稀释 将稀释好的药物加入前一天铺好细胞的细胞板上， 37E 5%CO2培养箱培养72h 荧光素酶检测：将 Celltiter-Glo 与 ddH0 以 1:1 混合，加入细胞板（96 板：20ul/well; 384 板: 10ul/well ），静置 10min 后，TECANnfinite F200 酶标仪读值。

6. 分析数据，绘制IC50曲线，寻找IC30,IC 50等值x稀释倍数最终得到的细胞密度填入下表，根据最终需要细胞浓度及体积进行稀释细胞数/孔起始浓度（/ml）所需体积（ml）需 20%FBS DMEf(ml)/I总体积终浓度（/ml）细胞株名D.稀释细胞7.验证IC50根据IC50曲线找出IC50理论值，分别取1/2倍、1倍及2倍的理论值进行药物浓度验证 附录：Materials for Experime ntNameCorporati on96-well plateCorni ng384-well plateGrei nerCe ntrifugeTube (15ml)BD Falco nPipets(10ml)Grei nerT-25 FlaskCorni ngTips,EP TubeAxyge n. MatrixReage nts for Experime ntNameCorporati onFBSExcellDPBSHyclone0.25%Trypsi n-EDTAGIBCOMediumHycloneCell-Titer Gio?PromegaIn strume nts for Experime ntNameModelCorporatio nInv erted MicroscopeTS100Niko nCO2 In cubatorBB16UVHeraeusBechtopZHJH-1109ZHCHENGCen trifuge5200KUBOTAMicroplate Readerinfinite F200TECANDispe nserpFillBio-Tek。