工业微生物产生菌的分离筛选课件.ppt

第五章第五章 工业微生物产生菌的分离筛选工业微生物产生菌的分离筛选第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 第二节第二节 含微生物样品的富集含微生物样品的富集 第三节第三节 微生物的分离微生物的分离 第四节第四节 野生型菌株的筛选和目的产物的鉴定野生型菌株的筛选和目的产物的鉴定 菌株分离（seperation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程 工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并迸行代谢产物鉴别菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：菌种可从以下几个途径进行收集和筛选： （（1 1））向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。

国内外著名的菌种保藏机构有：中国微选所需菌株国内外著名的菌种保藏机构有：中国微选所需菌株国内外著名的菌种保藏机构有：中国微选所需菌株国内外著名的菌种保藏机构有：中国微生物菌种保藏管理委员会（生物菌种保藏管理委员会（生物菌种保藏管理委员会（生物菌种保藏管理委员会（CCCCMCCCCM），美国典型菌），美国典型菌），美国典型菌），美国典型菌种保藏中心（种保藏中心（种保藏中心（种保藏中心（ATTCATTC），英国国家典型菌种保藏所），英国国家典型菌种保藏所），英国国家典型菌种保藏所），英国国家典型菌种保藏所（（（（NCTCNCTC），日本的大阪发酵研究所（），日本的大阪发酵研究所（），日本的大阪发酵研究所（），日本的大阪发酵研究所（IFOIFO）等 （（2 2））由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选从中进行分离筛选从中进行分离筛选从中进行分离筛选 （（3 3））从一些发酵制品中分离回的菌株，如从酱油中分从一些发酵制品中分离回的菌株，如从酱油中分从一些发酵制品中分离回的菌株，如从酱油中分从一些发酵制品中分离回的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产离蛋白酶产生菌，从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产离蛋白酶产生菌，从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产离蛋白酶产生菌，从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产生曲等。

该类发酵制品经过长期的人工选择，具有悠生曲等该类发酵制品经过长期的人工选择，具有悠生曲等该类发酵制品经过长期的人工选择，具有悠生曲等该类发酵制品经过长期的人工选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法 分离微生物新种的具体过程大体可分为:采样、增殖、分离纯化、性能测定 产物鉴别和生化鉴定几个步骤补充补充: 新菌种的分离筛选新菌种的分离筛选菌种的来源菌种的来源菌种的来源菌种的来源: :1 1、、根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、、高高等等院院校校、、工工厂厂或或菌菌种种保保藏藏部部门门索索取取或或购购买买；；2 2、、从从大大自自然然中中分分离离筛筛选选新新的微生物菌种的微生物菌种 新菌种的分离思路 ： 新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、、菌菌种种的的特特性性，，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，，快快速速、、准确地把所需要的菌种挑选出来。

准确地把所需要的菌种挑选出来 实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌，，也也必必须须重新进行分离纯化重新进行分离纯化 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合先进的设备与之配合定定定定方方方方案案案案：：：：首首先先要要查查阅阅资资料料，，了了解解所所需需菌菌种种的的生生长长培养特性培养特性采样：采样：采样：采样：有针对性地采集样品有针对性地采集样品增增增增殖殖殖殖：：：：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培条条件件，，使使所所需需菌菌种增殖培养后，在数量上占优势种增殖培养后，在数量上占优势分离：分离：分离：分离：利用分离技术得到纯种利用分离技术得到纯种发发发发酵酵酵酵性性性性能能能能测测测测定定定定：：：：进进行行生生产产性性能能测测定定这这些些特特性性包包括括形形态态、、培培养养特特征征、、营营养养要要求求、、生生理理生生化化特特性性、、发发酵酵周周期期、、产产品品品品种种和和产产量量、、耐耐受受最最高高温温度度、、生长和发酵最适温度、生长和发酵最适温度、最适最适pHpH值、提取工艺等。

值、提取工艺等新菌种分离与筛选的步骤新菌种分离与筛选的步骤增殖培养增殖培养n n 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，，可可以以通通过过配配制制选选择择性培养基，选择一定的培养条件来控制性培养基，选择一定的培养条件来控制n n 例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，，可可选选定定糖糖，，淀淀粉粉、、纤纤维维素素，，或或者者石石油油等等，，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰这这样样对对下下阶段的纯种分离就会顺利得多阶段的纯种分离就会顺利得多培养分离培养分离n n 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态因因此此还还必必须须分分离离，，纯纯化化在在这这——步步，，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，，而而且且控控制制得得细细一一点点，，好好一一点点。

纯纯种种分分离离的的方法有划线分离法、稀释分离法方法有划线分离法、稀释分离法筛筛 选选n n 这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，，以以求求得得适适合于工业生产用菌种合于工业生产用菌种毒性试验毒性试验n n 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，，更更应应慎慎重重据据有有的的国国家家规规定定，，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、、脆脆壁壁酵酵母母、、黑黑曲曲霉霉、、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，，其其他他微微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。

和目标物 土壤土壤是微生物的大本营，是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；；果园树根土层果园树根土层中，酵母菌含量较高；中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌着较多的霉菌此外，此外，豆科植物根系土中，往往存在根豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等油厂周围土层中常见分解石油的微生物等季节、表面季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视  一、从土壤中采样一、从土壤中采样 1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103） 从自然界筛选从自然界筛选 （一）根据土壤特点（一）根据土壤特点（一）根据土壤特点（一）根据土壤特点 1 1．土壤有机质含量和通气状况．土壤有机质含量和通气状况．土壤有机质含量和通气状况．土壤有机质含量和通气状况 采土样最好的上层是采土样最好的上层是采土样最好的上层是采土样最好的上层是5-25cm5-25cm、一般每克上中、一般每克上中、一般每克上中、一般每克上中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。

总的来说酵母菌分菌和放线菌几乎都能分离到总的来说酵母菌分菌和放线菌几乎都能分离到总的来说酵母菌分菌和放线菌几乎都能分离到总的来说酵母菌分布土层最浅，约布土层最浅，约布土层最浅，约布土层最浅，约5-10 cm5-10 cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也；霉菌和好氧芽孢杆菌也；霉菌和好氧芽孢杆菌也；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层分布在浅土层分布在浅土层分布在浅土层 2 2．土壤的酸碱度和植被状况．土壤的酸碱度和植被状况．土壤的酸碱度和植被状况．土壤的酸碱度和植被状况 3 3．地理条件：南方、北方．地理条件：南方、北方．地理条件：南方、北方．地理条件：南方、北方 4 4．季节条件．季节条件．季节条件．季节条件 ：以温度适中，雨量不多的秋初为：以温度适中，雨量不多的秋初为：以温度适中，雨量不多的秋初为：以温度适中，雨量不多的秋初为好7—10 7—10 月月月月（二）采样方法（二）采样方法 用取样铲，将表层用取样铲，将表层用取样铲，将表层用取样铲，将表层5cm5cm左右的浮土除去，取左右的浮土除去，取左右的浮土除去，取左右的浮土除去，取5-5-25cm25cm处的土样处的土样处的土样处的土样1010～～～～25 g25 g，装入事先准准备好的塑料，装入事先准准备好的塑料，装入事先准准备好的塑料，装入事先准准备好的塑料袋内扎好、北方土壤干燥．在袋内扎好、北方土壤干燥．在袋内扎好、北方土壤干燥．在袋内扎好、北方土壤干燥．在10-30cm10-30cm处取样。

给处取样给处取样给处取样给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件一般样品取回后应马上分离间及其他环境条件一般样品取回后应马上分离间及其他环境条件一般样品取回后应马上分离间及其他环境条件一般样品取回后应马上分离以免微生物死亡但有时样品较多，或到外地取样，以免微生物死亡但有时样品较多，或到外地取样，以免微生物死亡但有时样品较多，或到外地取样，以免微生物死亡但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可采先用选择性路途遥远，难以做到及时分离，则可采先用选择性路途遥远，难以做到及时分离，则可采先用选择性路途遥远，难以做到及时分离，则可采先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走到一处将取好的培养基做好试管斜面，随身带走到一处将取好的培养基做好试管斜面，随身带走到一处将取好的培养基做好试管斜面，随身带走到一处将取好的土样混匀，取土样混匀，取土样混匀，取土样混匀，取3-4g3-4g撒到试管斜面上．这样可避免菌撒到试管斜面上．这样可避免菌撒到试管斜面上．这样可避免菌撒到试管斜面上．这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。

株因不能及时分离而死亡株因不能及时分离而死亡株因不能及时分离而死亡 为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量和和类类型型尽尽少少变变化化，，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离二、根据微生物生理特点取样 1．根据微生物的营养类型 每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异 若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的效果品，容易得到满意的效果 不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生长淀粉获得能源而生长 2．根据微生物的生理特性 三、特殊环境下采样1．局部环境条件的影响2．极端环境条件的影响 第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养一、控制培养基的营养成一、控制培养基的营养成分分1、根据微生物的营养特点、根据微生物的营养特点 例如例如: 酵母富集培养基酵母富集培养基 葡萄糖葡萄糖 5% 尿素尿素 0.1% (NH4)SO4 0.1% KH2PO4 0.25% Na2HPO4 0.05% MgSO4 7H2O 0.1% FeSO4 7H2O 0.01% 酵母膏酵母膏 0.05% 孟加拉红孟加拉红 1/3万万 PH=4.52、根据微生物的不同种类来选择富集培养基、根据微生物的不同种类来选择富集培养基例如例如: 丝状真菌的丝状真菌的 增殖增殖 可选用可选用 淀粉琼脂培养基淀粉琼脂培养基 但是要注意酵母浸膏的加量但是要注意酵母浸膏的加量,过多会刺激菌丝的生长过多会刺激菌丝的生长,而而不利于孢子的产生不利于孢子的产生.3、根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特、根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点来分离点来分离鉴别培养基(differential medium)选择培养基选择培养基(selective medium)用于鉴别不同类型微生物的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，变化，根据这种特征性变化根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分可将该种微生物与其他微生物区分开来。

开来用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基离出来的培养基根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长的微生物的生长，有利于所需微生物的生长鉴别培养基选择培养基选择培养基 第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养二、控制培养条件二、控制培养条件二、控制培养条件二、控制培养条件 从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性．从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性．从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性．从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性．100℃100℃100℃100℃很难很难很难很难杀死，要在杀死，要在杀死，要在杀死，要在121℃121℃121℃121℃才能彻底死亡、可先将土样加热到才能彻底死亡、可先将土样加热到才能彻底死亡、可先将土样加热到才能彻底死亡、可先将土样加热到80℃80℃80℃80℃或在或在或在或在50%50%50%50%乙醇乙醇乙醇乙醇溶液中浸泡溶液中浸泡溶液中浸泡溶液中浸泡1h1h1h1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。

在富集培养基中，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离在富集培养基中，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离在富集培养基中，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离在富集培养基中加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无抑制作用分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原阴性菌无抑制作用分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原阴性菌无抑制作用分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原阴性菌无抑制作用分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖的生长繁殖的生长繁殖的生长繁殖 筛选霉菌时，可在培养基中加人四环素等抗生素抑制细菌；分筛选霉菌时，可在培养基中加人四环素等抗生素抑制细菌；分筛选霉菌时，可在培养基中加人四环素等抗生素抑制细菌；分筛选霉菌时，可在培养基中加人四环素等抗生素抑制细菌；分离放线菌时，在样品悬浮液申加人离放线菌时，在样品悬浮液申加人离放线菌时，在样品悬浮液申加人离放线菌时，在样品悬浮液申加人10101010滴滴滴滴10101010％的酚或加青霉素（抑制％的酚或加青霉素（抑制％的酚或加青霉素（抑制％的酚或加青霉素（抑制G+G+G+G+菌）、链霉素（抑制菌）、链霉素（抑制菌）、链霉素（抑制菌）、链霉素（抑制G-G-G-G-菌）各菌）各菌）各菌）各30—50U30—50U30—50U30—50U／／／／mlmlmlml，以及丙酸钠，以及丙酸钠，以及丙酸钠，以及丙酸钠10ug10ug10ug10ug／／／／mlmlmlml（抑制菌类）抑制霉菌和细菌的生长、（抑制菌类）抑制霉菌和细菌的生长、（抑制菌类）抑制霉菌和细菌的生长、（抑制菌类）抑制霉菌和细菌的生长、 在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到加热到加热到加热到100℃100℃100℃100℃保温保温保温保温1h1h1h1h，可简少细菌和链霉菌的数量。

分离耐高浓度酒，可简少细菌和链霉菌的数量分离耐高浓度酒，可简少细菌和链霉菌的数量分离耐高浓度酒，可简少细菌和链霉菌的数量分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度度甘蔗溶液精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度度甘蔗溶液精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度度甘蔗溶液精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度度甘蔗溶液中处理一段时间杀死非目的的微生物后再迸行分离中处理一段时间杀死非目的的微生物后再迸行分离中处理一段时间杀死非目的的微生物后再迸行分离中处理一段时间杀死非目的的微生物后再迸行分离 对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率培养以提高分离工作效率培养以提高分离工作效率培养以提高分离工作效率  第三节第三节 微生物的分离微生物的分离一、好气及兼性微生物的分离一、好气及兼性微生物的分离“ “菌落纯菌落纯” ”: :如稀释涂布法，划线分离法，组织如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等分离法等 组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。

株 另一类是较细单细胞或单孢子分离方法，可达到另一类是较细单细胞或单孢子分离方法，可达到“ “菌株纯菌株纯” ”和和“ “细胞纯细胞纯” ”的水平这类方法需的水平这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操纵装置，采用专门的仪器设备，复杂的如显微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离、分离、 第三节第三节 微生物的分离微生物的分离（一）稀释涂布法（二）划线分离法（三）利用平皿的生化反应进行分离1．透明圈法2．变色圈法 3．生长圈法4．抑菌圈法纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法 透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法琼脂块培养法琼脂块培养法琼脂块培养法琼脂块培养法 一、好气及兼性微生物的分离方法（四）组织分离法（四）组织分离法1．对一般有病组织的分离方法2．食用菌孢子分离法 （1）组织分离法 （2）单孢子分离法：单孢子稀释一、好气及兼性微生物的分离方法（五）单细胞或单孢子分离法1、小滴分离纯化方法2、滤纸进法  二、通过控制营养和培养条件进行分离二、通过控制营养和培养条件进行分离1. 1.培养基的营养成分培养基的营养成分培养基的营养成分培养基的营养成分 2. 2.培养基的培养基的培养基的培养基的pHpH3. 3.排除不需要的菌类排除不需要的菌类排除不需要的菌类排除不需要的菌类（（（（1 1 1 1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为）分离细菌时，在培养基中加入浓度为）分离细菌时，在培养基中加入浓度为）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50U50U50U50U／／／／mlmlmlml制霉菌素；制霉菌素；制霉菌素；制霉菌素；可以抑制霉菌和酵母菌的生长。

可以抑制霉菌和酵母菌的生长可以抑制霉菌和酵母菌的生长可以抑制霉菌和酵母菌的生长2 2 2 2）分离放线菌时，在样品中加入）分离放线菌时，在样品中加入）分离放线菌时，在样品中加入）分离放线菌时，在样品中加入 0.05 0.05 0.05 0.05 ％十二烷基磺酸钠％十二烷基磺酸钠％十二烷基磺酸钠％十二烷基磺酸钠（（（（SDSSDSSDSSDS）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的菌发加人氟哌酸（菌发加人氟哌酸（菌发加人氟哌酸（菌发加人氟哌酸（5mg/L5mg/L5mg/L5mg/L））））+ + + +制霉菌素（制霉菌素（制霉菌素（制霉菌素（50mg/L50mg/L50mg/L50mg/L））））+ + + +卜青霉卜青霉卜青霉卜青霉素（素（素（素（0.5mg/L0.5mg/L0.5mg/L0.5mg/L）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。

菌的生长菌的生长菌的生长 （（（（3 3 3 3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各素和四环素各素和四环素各素和四环素各30U30U30U30U／／／／mlmlmlml，可以抑制细菌和放线菌生长可以抑制细菌和放线菌生长可以抑制细菌和放线菌生长可以抑制细菌和放线菌生长 （（（（4 4 4 4）分离根霉和毛霉时由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，）分离根霉和毛霉时由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，）分离根霉和毛霉时由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，）分离根霉和毛霉时由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落．通常在培养基中添加难以得到纯化的菌落．通常在培养基中添加难以得到纯化的菌落．通常在培养基中添加难以得到纯化的菌落．通常在培养基中添加0.1%0.1%0.1%0.1%去氧胆酸钠去氧胆酸钠去氧胆酸钠去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。

或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密4 4 4 4．控制培养温度．控制培养温度．控制培养温度．控制培养温度 三、厌氧菌的分离三、厌氧菌的分离（一）加还原剂（一）加还原剂 分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、D D型维型维生素生素C C、硫化钠等，操作时以最快的速度划线、硫化钠等，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充日内（充日COCO2 2或或N N2 2 也可），适温培养也可），适温培养二）焦性没食子酸法（二）焦性没食子酸法（三）平皿厌气培养法（三）平皿厌气培养法（四）试管厌气培养法（四）试管厌气培养法（五）玻璃板隔绝空气培养法（五）玻璃板隔绝空气培养法（六）生物吸氧法（六）生物吸氧法 （（1 1）保加利亚乳杆菌的分离筛选）保加利亚乳杆菌的分离筛选 （（2 2）嗜热链球菌的分离筛选）嗜热链球菌的分离筛选 第四节野生菌株的筛选和目的产物的鉴别第四节野生菌株的筛选和目的产物的鉴别 一、初筛一、初筛1 1．平板筛选．平板筛选 较粗放的检筛方法较粗放的检筛方法 2 2．摇瓶筛选．摇瓶筛选 效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广, ,通通过该法可淘汰过该法可淘汰85-90%85-90%不符合要求的微生物不符合要求的微生物 二、复筛二、复筛 一个菌株通常要重复一个菌株通常要重复3-53-5个瓶，培养后的发酵液采个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定用精确分析方法测定 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）→80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养3～～4天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型↓例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 --Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落极端环境中的微生物的筛选极端环境中的微生物的筛选 极端环境：极端环境： 高、低温环境高、低温环境 高盐环境高盐环境 高酸、高碱环境高酸、高碱环境 高压环境。

高压环境极端环境中的微生物极端环境中的微生物（一）嗜热微生物（一）嗜热微生物1、发现、发现地热泉地热泉热水系统热水系统 制糖厂制糖厂极端环境中的微生物极端环境中的微生物（一）嗜热微生物（一）嗜热微生物2、生存机制、生存机制（高温对微生物的一般影响是什么？）（高温对微生物的一般影响是什么？） 有限的保护机制：细胞膜的蜡质程度、震热蛋白有限的保护机制：细胞膜的蜡质程度、震热蛋白 极端嗜热菌的保护机制：高溶点脂肪、抗热蛋白、核酸极端嗜热菌的保护机制：高溶点脂肪、抗热蛋白、核酸保护蛋白保护蛋白（二）嗜冷微生物（二）嗜冷微生物1、发现、发现（红雪现象：嗜寒水藻）（红雪现象：嗜寒水藻） 极端环境中的微生物极端环境中的微生物耐寒喜温型耐寒喜温型嗜冷型嗜冷型（二）嗜冷微生物（二）嗜冷微生物2、生存机制、生存机制 特殊的酶、细膜含特殊的脂肪特殊的酶、细膜含特殊的脂肪极端环境中的微生物极端环境中的微生物PHAn nPHAPHA是聚羟基脂肪酸酯类材料的总称，目前产业化品种已有四代第是聚羟基脂肪酸酯类材料的总称，目前产业化品种已有四代。

第一代产品的典型代表为均聚物一代产品的典型代表为均聚物PHBPHB（聚（聚3-3-羟基丁酸酯）该材料脆性羟基丁酸酯）该材料脆性大，很难大规模应用为了改善加工性能，人们又研发了第二代产品大，很难大规模应用为了改善加工性能，人们又研发了第二代产品PHBVPHBV（聚（聚3-3-羟基丁酸酯羟基丁酸酯/3-/3-羟基戊酸酯共聚物）、第夏商周产品羟基戊酸酯共聚物）、第夏商周产品PHBHHxPHBHHx（（3-3-羟基丁酸酯羟基丁酸酯/3-/3-羟基己酸酯共聚物）以中举四代产品羟基己酸酯共聚物）以中举四代产品P34HBP34HB（聚（聚3-3-羟基丁酸酯羟基丁酸酯/4-/4-羟基丁酸酯共聚物）羟基丁酸酯共聚物） 　　　　P34HBP34HB克服了之前克服了之前塑料加工成型工艺塑料加工成型工艺塑料加工成型工艺塑料加工成型工艺产品可选单体少、成本高、产品可选单体少、成本高、难以产业化的难题，具有成本低、发酵效率高、综合性能优异、应用难以产业化的难题，具有成本低、发酵效率高、综合性能优异、应用范围广、可在传统塑料加工机械上加工成型等优点第四代产品范围广、可在传统塑料加工机械上加工成型等优点第四代产品P34HBP34HB的综合性能已接近聚乙烯、聚丙烯等通用塑料，并且还可以路的综合性能已接近聚乙烯、聚丙烯等通用塑料，并且还可以路程经过过程调整单体比例，来调节程经过过程调整单体比例，来调节P34HBP34HB性能，满足不同应用领域对性能，满足不同应用领域对范性和弹性的需要。

该公司表示，范性和弹性的需要该公司表示，P34HBP34HB不仅性能与石油基塑料接近，不仅性能与石油基塑料接近，成本也与石油基塑料相接近成本也与石油基塑料相接近 n n与各人熟知的与各人熟知的PLAPLA等有生命的物质基材料比拟，等有生命的物质基材料比拟，PHAPHA的显著优点是能的显著优点是能路程经过过程布路程经过过程布塑料加工工艺塑料加工工艺塑料加工工艺塑料加工工艺 pptppt局调节使最终产品适用于不同的应局调节使最终产品适用于不同的应用领域，而支撑这类优点的就是其单体的多样性用领域，而支撑这类优点的就是其单体的多样性 　　海内外研究证明，有生命的物质合成　　海内外研究证明，有生命的物质合成PHAPHA新材料的潜力几乎是无新材料的潜力几乎是无穷的在20002000年时人们就已发现了跨越年时人们就已发现了跨越150150种的种的PHAPHA单体单体布局单体单体布局变化和共聚物中不同单体比例的不同，给变化和共聚物中不同单体比例的不同，给PHAPHA布局变化带来了无穷可布局变化带来了无穷可能布局的多元化，又带来了性能的多样化布局的多元化，又带来了性能的多样化 　　　　PHAPHA可以坚硬如硬塑料，也可以绵软如弹性体，可以制成吹膜级、可以坚硬如硬塑料，也可以绵软如弹性体，可以制成吹膜级、压片级、吹瓶级、发泡级和弹性体级的产品。

路程经过过程调整单体压片级、吹瓶级、发泡级和弹性体级的产品路程经过过程调整单体配比，配比，PHAPHA产品质性格能可以横跨纤维、塑料、橡胶、热熔胶等不同产品质性格能可以横跨纤维、塑料、橡胶、热熔胶等不同范畴，加之范畴，加之PHAPHA兼具杰出的有生命的物质相容性，其应用领域已不局兼具杰出的有生命的物质相容性，其应用领域已不局限在单一的塑料成品，还可以在杀虫药缓释剂、高性能生化滤膜、医限在单一的塑料成品，还可以在杀虫药缓释剂、高性能生化滤膜、医疗药品缓释长效药物载体和骨钉、手术缝合疗药品缓释长效药物载体和骨钉、手术缝合塑料挤出成型工艺塑料挤出成型工艺塑料挤出成型工艺塑料挤出成型工艺线、人线、人的身体整容填充材料方面大显身手的身体整容填充材料方面大显身手 生物柴油Biodiesel基本内容n1、生物柴油研究的意义n2、生物柴油及生产方法n3、生物柴油的优缺点n4、生物柴油的国内外现状一、生物柴油研究的意义n世界石油资源的枯竭n石油资源对国家和个人的影响n2004年中国成为全球第二大石油消耗大国——3亿吨n生物柴油 二、生物柴油及生产方法n2.1 生物柴油n n——一种脂肪酸甲酯类化合物，通过植物油或动物脂肪与醇类化合物在催化剂存在下进行酯化反应生成n n原料——油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂，以及动物油脂、废餐饮油料。

n2.2生物柴油的生产方法n直接混合法n微乳化法n裂解法n酯化法n酯交换（醇解）法｝｝物理方法化学方法酯化-酯交换联合法生物柴油生产流程三、生物柴油的优缺点n n3.1 优点n n具有优良的环保优势n n运动粘度高n n安全性能好n n燃烧性能优良n n属于天然可再生性能源，减少人们对石油的依赖n n单独使用，也可与石化柴油调和使用，还可以作为添加剂提高燃烧效率n3.2 缺点n n低温启动性能不佳n n燃烧排放物中NOx 含量较高n n含有微量甲醇与甘油，会使接触的橡胶零件，如橡胶膜、密封圈、燃油管等逐渐降解n n油脂来源分散，品种复杂四、生物柴油的国内外现状n n4.1国外生物柴油发展现状n n4.2国内生物柴油发展现状4.1国外生物柴油发展现状n n美国——美国有4家生物柴油生产厂，总能力为30万吨/年n n德国——现有8家生物柴油生产厂，拥有300多个生物柴油加油站，2003年生产生物柴油50万t/an n法国——法国有7家生物柴油生产厂，总能力40万t/an n欧洲其他国家的生物柴油生产量为:捷克和斯洛伐克10万吨/年、比利时2万吨/年（2001年)、意大利12.5万吨/年、奥地利2.5万吨/年。

微藻制油　　微藻制油　　n n藻类含有大量的生物油脂，部分品种含油达藻类含有大量的生物油脂，部分品种含油达7070％，而且它们的光合作％，而且它们的光合作用效率高，生长迅速研究表明，每公顷土地上，玉米的年产油量只用效率高，生长迅速研究表明，每公顷土地上，玉米的年产油量只有有120120升，大豆为升，大豆为440440升，而藻类可达升，而藻类可达1.51.5万万~8~8万升，是玉米的数百倍万升，是玉米的数百倍因此，如果能找到最适宜的品种，加上培育得当，藻类将是非常有潜因此，如果能找到最适宜的品种，加上培育得当，藻类将是非常有潜力的生物柴油来源力的生物柴油来源　　据介绍，这些藻类属于微藻，是海带、紫菜的　　据介绍，这些藻类属于微藻，是海带、紫菜的“ “远亲远亲” ”不过微藻比细菌稍大，个头在几微米它们之所以是绿色的，是因为细胞内藻比细菌稍大，个头在几微米它们之所以是绿色的，是因为细胞内含有叶绿素，在适宜的温度下，微藻能大量吸收二氧化碳，并通过叶含有叶绿素，在适宜的温度下，微藻能大量吸收二氧化碳，并通过叶绿素的光合作用制造生长所需的养分待微藻长成经脱水干燥，就能绿素的光合作用制造生长所需的养分。

待微藻长成经脱水干燥，就能得到浅绿色的粉末从这些藻粉中可提取出油脂，经化学方法处理制得到浅绿色的粉末从这些藻粉中可提取出油脂，经化学方法处理制备出的生物柴油，其性质和成分与传统石化柴油非常相似，某些指标备出的生物柴油，其性质和成分与传统石化柴油非常相似，某些指标比如发动机低温启动性能甚至更好比如发动机低温启动性能甚至更好　　一般而言，科学家把玉米制油等作为生物质能利用的第一代技术，　　一般而言，科学家把玉米制油等作为生物质能利用的第一代技术，秸秆发电是第二代，而微藻制油就是第三代，其应用前景非常广阔秸秆发电是第二代，而微藻制油就是第三代，其应用前景非常广阔 生物制氢n n1.氢能的利用历史氢能的利用历史n n2.生物制氢研究发展历程及现状生物制氢研究发展历程及现状n n3.三大微生物制氢法三大微生物制氢法1.氢能利用的曲折史氢能利用的曲折史重视－ 20世经70年代世界性的能源危机爆发，制氢技的实用性及可行性得到高度的重视，当时的能源界将氢气誉为“未来燃料”.80年代能源危机结束之前，人们对各种氢源及其应用技术己经进行了大量的研究n n冷落－ 石油价格回落以后，氢气及其它替代能源的技术研究一度不再出现在一些国家的议事日程中。

n n重新重视－ 到了90年代，人们对由以化石燃料为基础的能源生产所带来的环境问题有了更为深入的认识利用化石燃料不是长久之计此时，世界再次把目光“聚焦”在制氢技术上氢能的优势n n1.地球上的氢元素十分丰富n n2.氢气是最洁净的燃料n n3.氢能的高效率n n4.氢是可储存的二次能源微生物为何能产生氢气？？微生物产氢的关键因素－微生物产氢的关键因素－产氢酶产氢酶n n产氢过程中能够使质子还原为氢气的酶有固氮酶和氢酶两种n n固氮酶是由两种蛋白质分子构成的金属复合蛋白酶,能催化还原氮气成氨，氢气作为副产物产生n n氢酶是微生物体内调节氢代谢的活性蛋白氢酶又可以分为吸氢酶、可逆性氢酶氢酶在微生物中主要功能是吸收固氮酶产生的氢气可逆性氢酶的吸氢过程是可逆的，吸氢酶的吸氢过程是不可逆的因此从产氢需求出发，常勾践吸氢酶基因缺陷的突变体以增加产氢的速率微生物制氢的三大方法微生物制氢的三大方法n n1.光合微生物产氢光合微生物产氢n n2.微生物水气转换制氢微生物水气转换制氢n n3.暗发酵制氢暗发酵制氢光合微生物产氢投入：光能产出：氢气光合微生物产氢直接光解产氢间接光解产氢光发酵产氢直接光解产氢直接光解产氢光能 光能自养型微生物 氢气 特点：直接利用光能产生氢气n n至今对细菌光合产氢的具体步骤没有定论n n设想反应机理以下式简单表示：n n6CO2 2+10H2 2O→C6 6H1212O6 6+4H2 2↑+8O2 2↑例－绿藻例－绿藻n n绿藻属于人类已知的最古老植物之一，通过进化形成了能生活在两个截然不同的环境中的本领。

n n当绿藻生活在平常的空气和阳光中时，它像其他植物一样具有光合作用光合作用利用阳光，水和二氧化碳生成氧气和植物维持生命所需要的化学物质。