逍遥散的抗抑郁研究毕业论文.doc

逍遥散的抗抑郁研究 摘要：探讨逍遥散的抗抑郁作用，为其疏肝解郁功效及临床应用提供药理学参考方法：采用小鼠的小鼠慢性温和不可预知应激(CUMS)结合孤养抑郁模型的建立、小鼠体重测定 、糖水消耗量实验 、小鼠自主活动测定、Morris水迷宫等实验观察逍遥散的抗抑郁作用关键词 抗抑郁 抑郁症是一种常见的精神疾病，近年来其发病率呈不断上升趋势，已成为全球性的主要精神卫生问题之一，与其相关的治疗药物日益受到重视逍遥散功用疏肝解郁、健脾养血，主治肝郁血虚脾弱之证，是调和肝脾的代表方药大量临床资料显示该方在精神科疾患治疗中运用广泛，特别是在抑郁症的辅助治疗中取得较好疗效已有报道显示逍遥散可减少行为绝望模型小鼠的不动时间，提高CUMS模型大鼠的糖水消耗量等，表现出抗抑郁效应为进一步验证其抗抑郁作用，本课题通过利用一系列轻、中等强度的不可预知刺激结合孤养方式对小鼠连续实施6周，造成CUMS结合孤养的小鼠抑郁模型，以小鼠体重变化、行为学指标和糖水消耗实验来判定逍遥散的抗抑郁作用糖水消耗量反映动物的奖赏反应程度，模型动物出现糖水饮用量下降的现象，称之为快感缺失，是抑郁症的核心症状。

本次实验结果表明：小鼠被施加慢性轻度不可预知应激结合孤养造模程序6周后，与空白组小鼠比较，其体重增长缓慢，小鼠的糖水饮用量明显降低，阳性药阿米替林给予后可逆转上述变化此外，实验中采用Morris水迷宫对模型小鼠的空间学习记忆能力进行检测，发现模型小鼠该能力明显下降Morris水迷宫检测的是动物的定向和搜索行为，能反应动物对陌生环境的学习和记忆能力因此，可以认为CUMS结合孤养的造模方式不仅可干预小鼠的生长，降低小鼠的活动性、社会交往能力，使模型小鼠出现抑郁症的核心症状-----快感缺失，而且还能模拟临床抑郁症患者思维迟钝、学习记忆能力下降的表现，表明本次实验小鼠抑郁模型复制成功模型动物在给予逍遥散治疗后，逍遥散30、20g·kg-1剂量组可不同程度逆转上述变化，表明逍遥散具有抗抑郁作用同时，研究采用小鼠自主活动实验，检测逍遥散在所试剂量下有无中枢兴奋作用实验结果表明，逍遥散在所试剂量下对小鼠的自主活动无影响，表明其无中枢兴奋作用，进一步明确了该方在所试剂量下的抗抑郁作用综上，逍遥散不仅具有较好的抗抑郁作用，还可提高正常及抑郁模型小鼠空间学习记忆能力，其作用可能与影响单胺类递质及抗氧化、改善脑内血液循环有关。

1实验材料1.1实验药品逍遥散水煎液：组成按照《方剂学》所载：柴胡9g，当归9g 白芍9g，白术9g，茯苓9g，甘草4.5g，薄荷少许，生姜一块药材均购自成都中医药大学附属医院老中医门诊部，经成都中医药大学中药标本中心卢先明教授鉴定，柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels.的干燥根，白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf.的干燥菌核，白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根茎，薄荷为唇形科植物薄荷Menthae haplocalyx Briq.的干燥地上部分制备方法：按比例取以上药材加8倍量水浸泡30min，加热煮沸，文火煎煮1h，趁热滤过；同法煎煮40min及30min；合并三次滤液，文火浓缩至含生药1g·ml-1和1.5g·ml-1，药液4℃冰箱保存备用。

煎剂采用高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》2005年版)对其中的芍药苷进行定量分析，制备满足样品含量范围的标准曲线(见图1)，计算样品中芍药苷的含量结果表明：逍遥散1.5g·ml-1、1g·ml-1及0.5g·ml-1水煎液中分别含芍药苷1.13mg·ml-1、0.75mg·ml-1和0.38mg·ml-1，色谱图见图2,3Fig1.Standard cuve of peoniflorin9.991Fig2.HPLC chromatography of peoniflorin9.402Fig3. HPLC chromatography of Xiaoyao powder decoction阿米替林：SIGMA公司，批号039K1600，临用时用生理盐水配成所需浓度溶液1.2实验试剂芍药苷对照品：中国药品生物制品检定所，批号：110736-2010260.9％氯化钠注射液：四川科伦药业股份有限公司，批号B051030R苦味酸：台山市众城化工有限公司，批号20090701雀巢奶粉：批号20100412A1.3实验动物及实验场地ICR小鼠，雄性，初始体重25-28g，四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：scxk（川）2008-24。

实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理科研三级实验室（NO. TCM-03-043）1.4实验仪器Postar218高效液相色谱仪：美国瓦里安公司液相进样针（25µl）：美国Hamilton CompanyVarian 325 UV/IS检测器：美国瓦里安公司MT-200 Morris水迷宫视频跟踪系统：成都泰盟科技有限公司BA-200小鼠避暗仪：成都泰盟科技有限公司ZZ-6小鼠自主活动测定仪：成都泰盟科技有限公司101C-2型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司 LD600-1型电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司BS323S型电子天平：德国Sartorious公司2 实验方法2.1逍遥散抗抑郁作用研究2.1.1逍遥散对慢性温和不可预知应激(CUMS)结合孤养抑郁模型动物的影响2.1.1.1动物分组及给药方法选取健康雄性ICR小鼠，初始体重25-28g，适应性饲养1周，5只/笼，期间进行糖水训练及开场实验，于造模前1d采用Morris水迷宫对小鼠进行学习记忆初筛(两轮共8次)，以两轮在1min内找到平台者为合格，否则予以淘汰以上指标结合体重，随机分为空白组，模型组，阿米替林组(10mg·kg-1)与逍遥散高、中、低剂量组(30、20、10 g·kg-1，分别为成人(70kg)临床日用剂量的30、20、10倍)。

除空白组5只/笼饲养外，其余各组均单笼饲养并实施造模程序造模2周后开始给药，药物组灌胃给予相应药液，模型组和空白组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，连续4周2.1.1.2实验方法2.1.1.2.1 小鼠慢性温和不可预知应激(CUMS)结合孤养抑郁模型的建立实验实施过程中，除空白组外，其余各组小鼠在6周内每天以2-3次的频率交替接受以下刺激：潮湿垫料(200ml水·笼-1)、异物刺激、置于空笼、4℃冷刺激(冷水游泳)5min、45℃热刺激5min(置于烘箱)、鼠笼450倾斜、1mA电刺激＋周期性噪音(10dB)、明暗颠倒、禁食、禁水等所有刺激随机安排并尽量保证不在同一时间点进行，使小鼠不能预料刺激的发生具体执行安排见表1Tab1. Protocol of Chronic Unpredictable Mild Stress 星期一星期二星期三星期四 星期五星期六星期日1W10:30热刺激17:00-22:00鼠笼倾斜 22:00-8:00潮湿垫料8:30-20:30禁食+合笼 22:3－9:00鼠笼倾斜10:00-次日6点明暗颠到10:00电刺激11:00-22:00沙子垫料10:00-12:004个明暗循环(30min/次)21:00热刺激9:00冷刺激10:30-15:30潮湿垫料8:00－22:00置空笼22:00－次日16:00禁食＋禁水2W7:30电刺激18:00-21:00 6明暗循21:3011:00置于空笼.14:30冷刺激.18:30-9:00沙子垫料11:30热刺激19:00-8:00鼠笼倾斜12:30-14:304个明暗循环7:00冷刺激13:00-15:00合笼 19:00-7:00潮湿垫料8:00-21:00沙子垫料 22:00-次日9:00鼠笼倾斜9:30电刺激22:00－次日16:00禁食＋禁水3W11:00-22:潮湿垫22:15-10:15沙子垫料12:30电刺激21:00热刺激7:00-20:00禁水.9:00-15:00合笼.21:00冷刺激8:00热刺激12:30-22:30沙子垫料 22:30-18:30明暗颠倒(10h/10h)20:30电刺激 22:30-8:00鼠笼倾斜20:00-22:00 4个明暗循环9:30冷刺激。

11:00-22:00置空笼22:00-16:00禁食、水4W9:30-12:00合笼20:30电刺激8:00-20:00置于空笼 20:30热刺激 22:30-9:00沙子垫料9:00-21:00置空笼 22:008:30潮湿垫料10:00-22:00鼠笼倾斜＋禁水7:00-11:00 8个明暗循环13：00冷刺激 20:008:00禁食9:30-21:00潮湿垫料 22:00-10:00明暗颠倒18:30电刺激22:00-16:00禁食+禁水5W11:00-13:00明暗循环17:00-22:3笼倾斜+潮湿垫料7;00-19:00禁水 20:00-8:00明暗颠(12h/12h)9:00冷刺激6:30电刺激20:30-8:30鼠笼倾斜10:00-22:30沙子垫料7:00热刺激14:00冷刺激22:30-9:00置于空笼9;30-21:30潮湿垫料+合笼1h 22:00-9:00置空笼 16:30电刺激 22:00－次日16:00禁食＋禁水6W10:00-22:00潮湿垫料7:00-19:00禁食21:30电刺激8:00热刺激12:30-10:30鼠笼倾斜8:00-20:00禁食20:30-10:30明暗循环 10;30-10:00异物刺激12:30-22:30潮湿垫料9:30热刺激12:00-22:00异物刺激8:30冷刺激14:00-15:00合笼21:30电刺激2.1.1.2.2 小鼠体重测定 分别在造模前1d，造模2、4和6周进行小鼠体重测定，计算小鼠体重增长数（造模后体重-造模前体重，g）。

2.1.1.2.3 糖水消耗量实验 实验前，在环境安静的条件下训练小鼠使其适应含糖饮水，2d/次，训练3次，然后在造模前1d和造模后的每周星期一测定糖水饮用量：小鼠禁食禁水18h后，每只小鼠给予2个已称重(初重，g)的喂水瓶(1瓶1％蔗糖水,1瓶白水)，1h后，取走水瓶并称量剩余液体重量(末重，g)，计算小鼠的糖水消耗量(初重-末重，g)2.1.1.2.4 小鼠自主活动测定分别在造模前1d和造模结束后1d进行小鼠自主活动测定，在环境安静的条件下将小鼠放入ZZ-6小鼠自主活动测定仪中，适应2min后观察4min内的活动次数2.2逍遥散对小鼠学习记忆能力的影响2.2.1实验方法2.2.1.1Morris水迷宫实验方法Morris水迷宫视频跟踪分析系统由水池、休息平台、记录装置和分析软件组成水池外有固定参照物如门、窗，挂件等实验者每次试验位置保持不变水中加牛奶至不透明，水温为22-24。